【摘 要】
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猪支原体肺炎是一种慢性呼吸系统疾病,被认为是生猪生长发育迟缓的主要原因之一,对养猪业造成了严重的经济损失。目前猪场主要使用弱毒疫苗或灭活疫苗对该病进行预防,但猪肺炎支原体体外培养困难,疫苗生产成本高,且保护性有限,因此迫切需要探索一种免疫性良好的新型疫苗。本研究通过生物信息学技术从猪肺炎支原体232菌株中选出了三个具有高免疫原性的抗原片段,将每个片段重复三次后用柔性连接肽首尾相连,形成一个命名为M
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猪支原体肺炎是一种慢性呼吸系统疾病,被认为是生猪生长发育迟缓的主要原因之一,对养猪业造成了严重的经济损失。目前猪场主要使用弱毒疫苗或灭活疫苗对该病进行预防,但猪肺炎支原体体外培养困难,疫苗生产成本高,且保护性有限,因此迫切需要探索一种免疫性良好的新型疫苗。本研究通过生物信息学技术从猪肺炎支原体232菌株中选出了三个具有高免疫原性的抗原片段,将每个片段重复三次后用柔性连接肽首尾相连,形成一个命名为Mhp2321092bp的多表位融合基因,在大肠杆菌系统中进行表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定后对其表达形式和最佳表达条件进行探索,然后将蛋白大量表达和纯化。分别使用小鼠His-tag抗体和猪Mhp特异性血清进行Western-blot试验,验证纯化后蛋白的免疫活性。将具有免疫活性的融合蛋白用弗式佐剂乳化,在第1、8、15天时腹腔注射BALB/c小鼠。收集免疫前和免疫后第22天的小鼠血清,分别检测血清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的含量,评估细胞免疫水平;使用免疫后的小鼠血清进行Western-blot试验,同时建立间接ELISA方法检测小鼠的特异性Ig G抗体,评估体液免疫水平。结果显示,Mhp2321092bp多表位融合蛋白是约60k Da大小的具有免疫活性的可溶性蛋白,在IPTG终浓度为0.8 m M、15℃诱导20 h的条件下表达量最高。小鼠免疫融合蛋白22天后血清中的IFN-γ含量与免疫前相比有显著提升,分别增加了423.16 pg/m L（高剂量组）、467.74 pg/m L（中剂量组）、269.52 pg/m L（低剂量组）;IL-2含量分别增加了145.16 pg/m L（高剂量组）、115.97 pg/m L（中剂量组）、14.03 pg/m L（低剂量组）;TNF-α含量与免疫前相比无显著性差异,分别增加了10.04 pg/m L（高剂量组）、6.86 pg/m L（中剂量组）、12.37 pg/m L（低剂量组）。免疫后小鼠血清的Western-blot试验发生了阳性反应,用建立的间接ELISA方法检测小鼠血清,发现各免疫剂量组小鼠均产生了高水平的特异性Ig G抗体。研究结果表明,以Mhp2321092bp多表位融合蛋白为免疫原的疫苗在诱导小鼠细胞免疫与体液免疫方面均有良好的效果,为Mhp基因工程多表位疫苗的探究奠定了基础。
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