杨树(Populus spp.)是我国用材林、防护林和绿化林的主要树种之一。随着杨树基因组测序的完成,杨树作为木本模式植物广泛应用于林木分子生物学研究。然而,对于杨树中次生壁的调控机制目前还了解不多。油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)是上世纪70年代在植物中发现的一种类固醇激素。研究发现,BRs在植物整个生长和发育中起重要的作用,其中包括细胞伸长、分裂与分化、细胞壁的合成、维管的分化、光形态建成、种子的休眠与萌发、根的发育、衰老以及生物和非生物胁迫等。目前对BRs对植物生长发育影响的研究主要集中在草本植物如水稻、豌豆、烟草和拟南芥中,而在木本植物中的作用鲜有报道。在草本植物中已经证实,BRs影响次生壁的形成,然而,BRs在木本植物次生壁形成过程中的作用目前尚不清楚。DWF4是BRs合成路径中的关键酶基因,它的突变将导致植物表现出矮化等特征,而外施油菜素内酯能回复突变体表型,说明DWF4基因在BRs生物合成及植物生长发育中起着重要作用。为了探讨BRs在杨树次生壁合成中的作用,本论文以毛白杨为研究对象,克隆了PtoDWF4,对其在调控杨树次生壁合成途径中的生物学功能进行了初步研究,主要结果如下:(1)毛白杨PtoDWF4编码一个由488个氨基酸组成的蛋白。进化树分析显示,该蛋白与拟南芥和毛果杨中的DWF4序列相似性分别高达74.08%和98.57%,氨基酸序列比对发现,PtoDWF4具有细胞色素P450家族保守的功能结构域。(2)实时定量PCR分析组织表达谱发现,PtoDWF4在毛白杨的根、茎、木质部、韧皮部、幼叶和成熟叶中均有表达,在茎的木质部中表达量最高,暗示PtoDWF4可能参与了对植物次生壁中木质部的调控。(3)过量表达PtoDWF4导致转基因杨树植株促进了植株株高及茎直径等指标上升,提高了转基因杨树的生物量。而通过CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术获得的PtoDWF4突变体表现出植株矮小、茎变细等症状,表明PtoDWF4可能参与了杨树次生壁的生物合成调控。(4)对植株的茎进行组织切片和甲苯胺蓝化学染色后观察发现,超表达PtoDWF4的转基因植株茎中次生木质部层数明显多于野生型,而敲除PtoDWF4株系的茎中表现出相反表型,揭示PtoDWF4参与了杨树茎干中次生木质部的合成调控。(5)次生壁组分分析显示,超表达PtoDWF4的转基因植株中次生壁中木质素、木聚糖、纤维素等组分均上调,而敲除PtoDWF4的株系中发生了显著下调。上述结果证明PtoDWF4在杨树次生壁合成中起重要的调控作用。(6)荧光定量PCR检测显示,超表达PtoDWF4的转基因植株中,BRs合成途径上DWF4下游基因的相对表达量被上调,而敲除PtoDWF4的植株中有一定的下降。而超量表达PtoDWF4的转基因杨树中木质素、木聚糖、纤维素合成相关的结构基因均一定程度上调,相反,敲除PtoDWF4的株系中这些基因均显著下调。在检测次生壁合成相关的NAC/MYB转录因子时也发现了类似的结果。上述结果表明,PtoDWF4基因通过调控BRs的合成进而影响杨树次生壁的形成。综上所述,本论文克隆了BR合成通路中的关键酶基因PtoDWF4,并通过转基因技术、基因敲除技术、组织化学及分子实验等方法,初步分析了该基因在杨树次生壁合成中的生物学功能,推测PtoDWF4可能是通过合成BRs,激活次生壁合成途径上多个关键酶基因和相关转录因子,进而调控杨树次生壁的形成。本研究为杨树材性遗传改良提供了一定的理论基础。