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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease,AD）,又称老年痴呆,是以记忆、认知功能受损为主要特征的神经退行性疾病,其典型的病理学改变为老年斑（senile plaque, SP）、神经纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFT）和大量的神经元丧失。β-淀粉样蛋白（β-amyloid beta protein,Aβ）是老年斑的主要成分,由39～43个氨基酸组成。研究发现Aβ25-35,一个短的分子片段具有与Aβ完整肽链相同的神经毒作用,因此被广泛应用于AD的实验研究。有关AD病因和发病机制的学说很多,目前尚无定论,但普遍认为Aβ在AD发病过程中发挥着重要作用。因此深入研究其毒性作用机制,对理解AD的病理机制及防治具有重要作用。研究证实,电压依赖性钾通道广泛分布于中枢神经系统,主要通过影响动作电位的形成、动作电位的形状,调节动作电位的频率,调整静息膜电位等影响神经功能活动包括学习和记忆等。在海马神经元上至少存在两种电压门控性钾通道,即快速激活并快速失活的瞬时外向钾电流（IA）和缓慢激活且几乎不失活的延迟整流钾电流（IK）。研究表明钾通道参与与老化有关的认知功能的损伤,在学习和记忆过程中起重要作用。而IA电流是动作电位复极化早期外向电流的主要成分,在调节神经元放电频率,动作电位的产生以及放电模式等方面具有重要作用。大量实验证明, IA的动力学特征受磷酸化调节,激活蛋白激酶A （protein kinase A, PKA）可使海马锥体细胞IA通道的开放概率明显降低,从而导致动作电位的延长,引起Ca2+的大量内流,同时触发一些神经递质的释放。有研究证实cAMP/PKA-CREB通路在记忆形成中起着重要的作用。在AD中存在PKA-CREB信号通路功能障碍。研究显示,Aβ在低浓度即可引起PKA-CREB信号通路功能异常,引起与学习记忆功能密切相关的海马CA1区长时程增强（long-term potentiation, LTP）被抑制。本实验室前期研究已观察到Aβ可以显著抑制电压门控性钾通道（包括IA和IK）,由此我们推测Aβ25-35对IA电流的抑制可能与PKA途径的活化有关,或PKA可能介导了Aβ25-35对IA电流的抑制作用。Humanin （HN）是一种新近发现的神经保护肽,研究显示,HN能特异性的抑制家族性阿尔茨海默病（familial Alzheimer‘s disease,FAD）基因突变及Aβ沉积等诱发的神经元死亡。并且可通过拮抗Aβ25-35诱导的PKC活化从而拮抗Aβ25-35诱导的对IK电流的抑制。HN是否也能通过拮抗Aβ25-35诱导的PKA活化从而拮抗Aβ25-35诱导的对IA电流的抑制呢?基于上述推测,我们采用全细胞膜片钳技术观察PKA在Aβ引起钾通道功能改变过程中的作用和HN的拮抗作用。以阐明Aβ引起钾通道功能异常的机制及HN的保护作用。方法:1、海马神经元的分离提取选用7-10天的SD大鼠海马神经元,分离出CA1区制成细胞悬液,加到培养皿上。待细胞贴壁后,加入2ml洁净细胞外液倒置显微镜下进行膜片钳记录。2、实验分组对照组、Aβ组（5μmol/L）、HN组（5μmol/L）、8-brom-camp组（5μmol/L、50μmol/L、500μmol/L）、H-89（10μmol/L）+ Aβ组（5μmol/L）3、电生理测量全细胞膜片钳模式采用电压钳记录模式,在记录条件下给予细胞由-40～+70mV（阶跃10mV）的去极化脉冲,分别记录电压依赖总的钾电流和IK电流,再经公式换算得出IA。IK取其158ms处的稳态电流,而IA取其峰值电流进行分析。在同一海马神经元上,比较不同的给药方式引起的钾电流的变化。4、数据分析测定结果数据均以x ? s表示,运用SPSS13.0软件进行单因素方差分析,加药前后的差异显著性用t检验进行分析。检验水准α=0.05,P<0.05表示有显著性差异。结果:1、Aβ25-35 （5μmol/L）使电压依赖性的全钾电流和IA电流都受到明显抑制。+70mV去极化脉冲下, Aβ25-35单独作用使全钾电流幅度从对照组的3421.70±409.98pA降低为2022.60±442.68pA,与对照组相比电流幅度降低59.11±12.94%（n=5,p<0.05 ）;IA电流从对照组的2196.77±170.56pA降低为1340.61±259.71pA,与对照组相比电流幅度降低61.03±11.82%（n=5,p<0.05）。2、PKA拮抗剂H-89（10μmol/L）能够阻断Aβ引起的对IA的抑制。联合使用H-89和Aβ时,取消了Aβ对钾电流的抑制,全钾电流和IA电流基本恢复至对照组水平,相对于正常电流幅度分别为104.78±10.19%（n=5）和119.68±22.87%（n=5）;而同单独应用Aβ25-35 （5μmol/L）时两种电流的相对值均有统计学差异（p<0.05）;3、不同浓度的PKA激动剂8-brom-camp（5μmol/L、50μmol/L、500μmol/L）能够剂量依赖性抑制瞬时外向钾电流（IA）,相对于对照组电流,IA的电流幅度分别降低87.18±15.33 %（n=5, p>0.05）, 59.91±5.11% （n=5, p<0.05）, 46.59±2.56% （n=5, p<0.05）。而延迟整流钾电流（IK）则略有上升,但无统计学差异;4、HN （5μmol/L）拮抗Aβ引起的对全钾电流和IA电流的抑制;同时HN也可拮抗PKA激动剂8-brom-camp （50μmol/L）引起的对IA电流的抑制。在Aβ之后给予HN（5μmol/L）全钾电流和IA电流幅度分别从2022.60±442.68pA和1340.61±259.71pA升高为2952.00±272.01pA和1928.63±172.68pA（n=5,p<0.05 ）,分别是对照组的86.27±7.95%和87.79±7.86%。与Aβ25-35组相比,均有统计学差异。而在8-brom-camp之后给予HN （5μmol/L）,IA相对电流幅度从59.91±5.11%升高为对照组的78.68±10.00%（n=5）。结论:1、急性给予Aβ25-35抑制了电压依赖性的全钾电流、IA电流。2、PKA介导了Aβ对IA的抑制作用,通过活化PKA途径实现对IA的抑制可能是Aβ毒性作用的机制之一。3、HN拮抗了Aβ25-35对IA的抑制作用,与此同时HN拮抗了PKA激动剂引起的对IA的抑制。抑制Aβ对PKA的活化及由此引起的毒性作用可能是HN拮抗Aβ毒性作用的机制之一。