铜绿假单胞菌缺失突变体PAO1(Δ4429-31)转录组学分析

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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是自然界中常见的革兰氏阴性致病菌,可引起严重的医院感染和诱发肺囊性纤维化(pulmonary cystic fibrosis,CF),同时,铜绿假单胞菌所属的假单胞菌属也被世界卫生组织列为三大致病菌之一。前期研究发现,PA4429-31参与编码细胞色素bc1,该酶是PA有氧呼吸第三阶段反应酶,即:复合物III。当PA4429-31发生缺失突变,观察到缺失突变株PAO1(Δ4429-31)的致病性下降,对氨基糖胺类抗生素耐药性上升。为了初探PA4429-31调控铜绿假单胞菌致病性和氨基糖胺类抗生素耐药性的机制,挖掘PA4429-31参与铜绿假单胞菌更多生理变化反应信息,本研究将缺失突变体PAO1(Δ4429-31)和野生型PAO1进行转录组测序分析。研究通过转录测序片段统计分析和构建p KD-alg A,p KD-fur,p KD-las A,p KD-pqs A,p KD-ton B1五种发光报道子将测序数据进行质量验证的实验结果显示,转录测序质量良好,可信值高。转录测序结果得到,PAO1(Δ4429-31)中共有293个基因发生显著改变,其中145个表达下调,148个表达上调;同时差异基因(DEGs)的GO/KEGG pathway分析结果显示,293个DEGs广泛富集在双组分系统,铁离子吸收系统,氧化磷酸化途径,芳香族化合物代谢和碳代谢等多种生理代谢途径。为进一步探究PA4429-31能否通过影响差异富集通路的表达调控突变株致病性、氨基糖苷类抗生素耐药性表型,本研究将显著富集代谢通路进一步进行热图富集分析和实验探究,结果如下。脂肪酸合成和呼吸系统热图结果说明,PAO1(Δ4429-31)的脂肪酸合成和无氧呼吸代谢表达在转录水平上升,同时一氧化氮和生物膜测定结果也说明PAO1(Δ4429-31)的无氧呼吸速率增加,生物膜加厚。结合以上实验结果推测,PA4429-31发生缺失突变后,通过诱导脂肪酸合成和一氧化氮产生,双重作用于PAO1(Δ4429-31)生物膜,造成生物膜含量增厚,这可能是PAO1(Δ4429-31)对氨基糖胺类抗生素耐药性增加的原因之一。群体感应系统热图分析和PQS信号分子检测结果说明,PAO1(Δ4429-31)的群体感应系统表达降低,同时邻氨基苯甲酸作为PQS信号分子合成前体,其降解转录表达水平远大于合成转录表达水平,以上实验结果说明,PAO1(Δ4429-31)可能通过降低邻氨基苯甲酸产量调控PQS信号分子分泌量,继而降低pqs系统表达。为探究PAO1(Δ4429-31)中邻氨基苯甲酸产量降低的原因,本研究对PAO1(Δ4429-31)细胞内铁离子含量和两种小RNA分子(s RNAs)--Prr F1、Prr F2的表达进行检测。结果显示,突变株细胞内铁离子含量与Prr F1、Prr F2表达都下降,因此结合以上实验结果推测得到,PAO1(Δ4429-31)中Prr F1、Prr F2的低表达解除对邻氨基苯甲酸降解过程的抑制作用,令邻氨基苯甲酸降解速率加快,造成PQS信号分子产量降低,继而降低pqs系统,甚至是群体感应系统的表达,文献研究群体感应系统和细胞内铁离子水平共同影响铜绿假单胞菌致病性。因此结合以上结果推测,铁离子含量和群体感应系统的低表达,可能是造成PAO1(Δ4429-31)致病性降低的原因。最后研究通过检测铁载体--pyoverdine产量,初探PAO1(Δ4429-31)细胞内铁离子含量下降的原因,研究结果表明,PAO1(Δ4429-31)中铁离子含量下降与pyoverdine无关。此外本研究还对PAO1(Δ4429-31)中显著差异表达的五种s RNAs,NC-002516-pred RNA1,NC-002516-pred RNA40,NC-002516-pred RNA274,NC-002516-pred RNA97和NC-002516-pred RNA89进行靶基因预测以及靶基因功能通路信息预测注释。预测结果说明PA4429-31可能通过调节该五种s RNAs的表达水平,影响铜绿假单胞菌DNA的修复,金属离子运输和稳态,碳元素代谢合成,芳香族氨基酸代谢等多种表型变化。总的来说,本研究通过转录组学分析结合实验研究初探PA4429-31调控铜绿假单胞菌致病性、耐药性的机制,为未来深入探究呼吸链的组成和功能,寻找治疗铜绿假单胞菌感染的新方法提供了研究方向。
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