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目的乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，近年来发病率呈明显上升趋势。线粒体融合蛋白2（Mitofusin2，Mfn2）是一种新发现的抑癌基因，能抑制包括乳腺癌细胞在内的多种肿瘤细胞的增殖。本课题旨在利用人乳腺癌细胞株MCF-7，研究蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）介导的Mfn2蛋白第442位丝氨酸的磷酸化修饰对其调控乳腺癌细胞增殖功能的重要性及相关机制，为临床应用提供理论依据。方法以人正常乳腺组织cDNA为模板，以pEGFP-N1质粒为载体，分别构建基因表达质粒：含Mfn2开放阅读框（open reading frame，ORF）全长的pEGFP-Mfn2质粒和含去除第442位丝氨酸编码DNA序列的Mfn2的ORF的pEGFP-Mfn2-PKA(△)质粒。将实验分为4组，Mock组（未转染空白对照）、N1组（转染pEGFP-N1）、Mfn2组（转染pEGFP-Mfn2）和Mfn2-PKA(△)组（转染pEGFP-Mfn2-PKA(△)）。在脂质体介导下将质粒转染MCF-7细胞。转染48h后，用荧光显微镜检测各组转染效率，用实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）和免疫细胞化学法检测Mfn2的mRNA及蛋白表达水平，以确定Mfn2是否在MCF-7细胞内被转录并翻译。通过细胞计数法、MTT法评估转染后72h内的细胞增殖情况；利用流式细胞仪检测转染48h后细胞周期分布情况。用western blot法检测转染48h后在血清刺激下磷酸化ERK1/2（Phosphorylation extracellular regulated protein kinases1/2, p-ERK1/2）的蛋白水平。结果从人乳腺组织中扩增出全长为2274bp的Mfn2基因，然后突变得到长为2271bp的Mfn2-PKA(△)基因。构建相应的基因表达质粒pEGFP-Mfn2和pEGFP-Mfn2-PKA(△)，经DNA测序证实与GenBank中ORF序列相符，证明质粒构建成功。转染48h后，荧光显微镜显示，N1组、Mfn2组、Mfn2-PKA(△)组都表达绿色荧光蛋白，证明转染成功且效率均约为60%。RT-qPCR法检测结果显示，与N1组和Mock组相比，Mfn2-PKA(△)组和Mfn2组中Mfn2的mRNA水平显著升高（P<0.05），且Mfn2-PKA(△)组和Mfn2组之间无显著差异（P>0.05）。免疫细胞化学法检测结果显示：Mfn2和Mfn2-PKA(△)的蛋白产物均定位在细胞质，与N1组和Mock组相比，Mfn2-PKA(△)组和Mfn2组的Mfn2蛋白水平显著升高（P<0.05），且Mfn2-PKA(△)组和Mfn2组之间无显著差异（P>0.05）。细胞计数和MTT检测结果显示：转染48h、72h后，Mfn2-PKA(△)组的细胞增殖能力均与N1组和Mock组相似（P>0.05），显著高于Mfn2组（P<0.05）。流式细胞仪的检测结果显示：Mfn2组的细胞周期多阻滞在G1期，与之相比，Mfn2-PKA(△)组的G1期细胞显著减少（P<0.05），细胞周期分布与N1组和Mock组相似（P>0.05）。Western blot的结果显示：各组中ERK1/2的蛋白水平一致，而Mfn2-PKA(△)组的p-ERK1/2蛋白水平与N1组和Mock组相似（P>0.05），显著高于Mfn2组（P<0.05）。结论在MCF-7细胞内，外源性的Mfn2和Mfn2-PKA(△)在mRNA和蛋白水平都能成功转录和表达。Mfn2过表达可以抑制MCF-7细胞增殖，进而阻滞乳腺癌细胞周期于G0/G1期，这可能与Ras-ERK1/2信号通路中的关键蛋白ERK1/2的磷酸化水平降低有关。然而去除第442位丝氨酸后，Mfn2-PKA(△)蛋白失去抑制MCF-7细胞增殖的作用，不能下调ERK1/2的磷酸化水平。这些结果表明，Mfn2蛋白第442位丝氨酸的磷酸化是其发挥抑制肿瘤细胞增殖作用所必需的。Ras-ERK1/2信号通路可能是磷酸化Mfn2的一个下游通路。