胶类中药由动物的皮、甲、骨、鳞或角等药用部位经过长时间熬制等加工而成,主要具有补血、止血等功效。由于胶类中药需求量大,市面上伪品和掺伪品较多,如猪皮胶和杂皮胶等,因而成为近年来鉴定研究的热点。《中国药典》中胶类中药的质量控制体系虽然愈发完善,然而其专属性鉴定的研究基础仍然相对薄弱。因此,开展相应的基础研究并最终实现对胶类中药的准确鉴别显得十分急迫。本论文围绕胶类中药及其基源动物药用部位中的蛋白质开展了分析研究,以期为胶类中药的鉴定提供依据,并为胶类中药的补益活性物质研究奠定基础。研究内容分为以下几个部分:1.胶类中药蛋白质的含量测定与比较以水作为溶剂,料液比为1 100,85℃恒温水浴加热20 mins,制备胶类中药供试液,并采用Bradford和BCA法测定蛋白质含量。结果表明,Bradford法(4.64%~12.74%)测定的胶类中药对照药材的蛋白质含量远低于BCA法(35.82%~46.28%),提示精氨酸(Arg)和芳香性氨基酸(如Phe、Tyr、Trp)可能并不是组成胶类中药中蛋白质的主要氨基酸。此外,不同批次的阿胶、龟甲胶和鹿角胶商品中蛋白质的含量有一定差异;其中,阿胶蛋白质含量与其对照药材差异较小,而龟甲胶和鹿角胶的蛋白质含量均高于相应的对照药材。2.胶类中药氨基酸及胶原蛋白的含量测定利用氨基酸分析仪测定胶类中药中17种氨基酸的含量。结果表明,胶类中药中氨基酸种类和含量较为丰富;阿胶、龟甲胶、鹿角胶中氨基酸含量的高低顺序基本一致,尤其是Gly和Pro的含量较高。主成分分析可知,Gly、Pro为三种胶类中药的共同特征氨基酸,表明其蛋白质类化学成分主要由胶原蛋白构成。此外,聚类分析显示,市售胶类中药商品大致可被归为三类。然后,以柱前衍生化-高效液相色谱法测定了胶类中药的L-Hyp,并以折算系数计算胶原蛋白的含量。结果表明,阿胶、龟甲胶和鹿角胶对照药材的L-Hyp含量依次为9.11%、6.93%和8.06%,胶原蛋白含量为64.65%、76.92%和57.23%。18批胶类中药商品中L-Hyp和胶原蛋白的含量有一定差异;阿胶商品与对照药材中两者的含量较为接近,而鹿角胶和龟甲胶商品中两者的含量均远高于对照药材。3.基源动物药用部位及胶类中药中蛋白质的电泳分析利用SDS-PAGE分析了胶原、基源动物药用部位和胶类中药的蛋白质组成。结果表明,基源动物药用部位(驴皮、龟甲和鹿角脱盘)含有丰富的蛋白质,且在10 k Da~250 k Da区间均有分布,而经加工后得到的阿胶、龟甲胶和鹿角胶中蛋白质均呈弥散分布,未见明显条带。三种胶类中药的SDS-PAGE及2-DE蛋白谱的主要差别在于:阿胶中蛋白质的分子量范围介于15 k Da~250 k Da,甚至更高,而鹿角胶和龟甲胶则基本上<50 k Da,区域有所不同,可为胶类中药的鉴定提供一定参考。4.药用部位蛋白质在加工过程中的动态变化基于电泳技术研究了药用部位蛋白质在加工过程中的动态变化。结果表明,经短时间煎煮,驴皮、龟甲和鹿角脱盘中的蛋白质能够较快地被溶出,可能含有水溶性蛋白质和盐溶性蛋白质。此后,随着煎煮时间的延长以及加入辅料(冰糖、黄酒和豆油),药用部位中大分子的蛋白质可能发生了较为复杂的结构变化(如蛋白质降解、聚合),泳道逐渐出现弥散现象。5.胰蛋白酶消化—MALDI-TOF/TOF-MS分析胶类中药的多肽片段以SDS-PAGE分离得到的蛋白质条带为来源,经MALDI-TOF/TOF-MS分析并进行数据库匹配检索,从驴皮中鉴定出7个特征蛋白,从龟甲中鉴定出1个特征蛋白;以2-DE分离得到的蛋白质斑点为来源,经MALDI-TOF/TOF-MS分析并进行数据库匹配检索,从驴皮中鉴定出另外12个特征蛋白,从龟甲中鉴定出另外6个特征蛋白。此外,利用胰蛋白酶消化胶类中药蛋白质(50~75 k Da及25 k Da上方),将所得到的多肽片段混合物以MALDI-TOF/TOF-MS进行分析,获取了多肽片段的指纹图谱,并从中选取了32个差异性多肽片段,以期为胶类中药的鉴定提供参考。6.胶原蛋白酶消化—Nano LC-Orbitrap MSD分析胶类中药的多肽片段以胶原蛋白酶分别消化阿胶、鹿角胶和龟甲胶的总蛋白质得到肽段混合物,并利用Nano LC-Orbitrap MSD进行分析,然后通过Mascot检索和PEAKS软件de novo sequencing解析了肽段的氨基酸序列,并从中发现了共计14个潜在特征性肽段,其中5个来源于阿胶,5个来源于龟甲胶,4个来源于鹿角胶。此外,将这些潜在特征性肽段导入BLAST在线分析并nrdb为依托,发现它们大部分来源于哺乳动物。