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鉴于苏云金芽胞杆菌杀虫剂在农林害虫防治中占有重要地位，国外相继研制出了不同的高效工程菌杀虫剂。然而，我国目前仍处于使用天然菌株进行发酵生产的落后状况。因此，本研究围绕进一步提高苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白产量和杀虫活性，构建工程菌这一主题，进行了以下两个方面的基础研究。 一、苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因在不同受体菌中的表达 1．将cryⅠ基因的高保守区的cryⅠA（a）Ecog Ⅰ-F片段插入带有T7 RNA聚合酶启动子的质粒pSELECT-1，获得了能在体外转录的RNA探针载体pBPL-1，用该载体制备的RNA探针具有特异强，背景清楚，省时省力等优点，已成功地用于苏云金芽胞杆菌的分子生物学研究和特异菌株的筛选。 2．利用cryⅠA（a）EcoR Ⅰ-F片段RNA探针和cryⅠ混合特异引物对本室筛选的苏云金芽胞杆菌菌株YBT803和YBT-791的质粒进行了基因杂交定位和基因型的PCR分析。并将携带有cryⅠA（b）和cryⅡ基因的38MDa质粒分别电转化到不同血清型苏云金芽胞杆菌无晶体突变株4D10(H3ab)和Bti IPS·78／11(H14)中，证明了相同基因型在不同血清型受体中有不同的杀虫活性。建立了一个利用电转化技术构建遗传改良工程菌的新模式。 3．将含有cryaⅠ因的苏云金芽胞杆菌YBT-803质粒的7.9kb和4.4kb片段与穿梭载体pX161重组，获得了大肠杆菌克隆株EL-1和EL-2。PCR分析表明7.9kb片段含有cryⅠA（b）基因，4.4kb片段兼有cryⅠA（b）和cryⅠA（a）基因型的特征谱带。对4.4kb片段进行了部分序列分析，绘出了基因上游650bp序列的精确酶谱。SDS-PAGE分析表明，EL～1和EL-2均可表达130kDa蛋白质。这一结果表明克隆的两个片段含有完整的结构基因，可直接用于构建基因重组工程菌和进一步的分子生物学研究。同时，将重组质粒pBL-1、pBL-2和pBL-3分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株Bti IPS·78／11和4D10，获克隆株BL-1，BL-2和BL-3。通过SDS-PAGE分析和生物测定，证明了不同载体对表达产物稳定性及杀虫活性有直接影响。 4．为研究杀虫晶体蛋白基因在荧光假单胞菌中的表达特性，利用多寄主质粒pSUP106探索了不同CaCl2浓度和细胞不同生长时期对转化频率的影响，建立了一个简便易行的转化方法，奠定了异源基因在荧光假单胞菌中克隆与表达研究的基础。 5．利用上述转化方法将苏云金芽胞杆菌YBT-791的cryⅠA（b）基因通过与pSUP106重组转化荧光假单胞菌Pfx-18，获得克隆株BPL-1。SDS-PAGE分析表明，克隆子BPL-1表达66kDa的蛋白质和一些小分子多肽。稀释1000倍发酵液对三龄小菜蛾幼虫的致死率为33％，这一研究奠定了构建杀虫抗病荧光假单胞菌工程菌的基础。 二、苏云金芽胞杆菌以色列亚种辅助蛋白基因的研究 1．根据NcoⅠ识别位点CCATGG含有结构基因起始密码ATG这一序列特征和苏云金 芽胞杆菌以色列亚种辅助蛋白川夕基因的序列，利用PCR定点诱变技术，通过A川n1i厅 程序设计一r一套分别含有万coI位点的特异引物，使扩增的基因正好处在表达载休启动 子控制下的正确阅读框内.这一重组技术克服了传统方法上结构基因起始密码处必须 具备合适的酶切位点才可以正确重组的限制，使得任何结构基因都可以进行重组并保 证结构基因不发生任何突变，作者用这一技术成功地克隆了能够正确表达的以色列亚 种辅助蛋白尸1夕基因，并对其进行了序列分析，确证了尸1丝吉构基因的正确性. 2.将p了夕和cy时基因以及它们重组休插人大肠杆菌表达载休pUHE一24，分别获得了 3种重组质粒PLZ19、pLZcytA和休21 gA.将重组质粒转化到不同大肠杆菌受休菌 xLI，DHS仪，获得了5种含有不同基因型的转化子.测定了不同转化子基因表达产物 与伪tA的相互作用对大肠杆菌受体菌生长的影响。发现了PI夕基因对cy“基因的表达具 有增效作用.这一发现在国际上尚属首次报道.它不仅对苏云金芽胞杆菌工程菌的构 建具有现实意义，而且对其它基因高表达研究将产生积极影响，具有一定的理论意义 和潜在的应用价值. 3.用上述重组技术获得了含有刀口基因的LZ20和含有尸2拼即“的LZ20A克隆株， 通过基因的诱导表达，发现p”和pZ浏民有不同的作用机制，证明了P20具有保护Cyt人 溶细胞的作用，这种作用并不依赖大肠杆菌受休的不同而改变. 4.把携带有苏云金芽胞杆菌核糖休结合位点的pZ窿因与pLzl gA重组.获得克隆 子Lzng-一20A和LZr19一20A.在IPTG诱导下，不管插人的尸2叹基因是正向还是反向，都 能保护Cyt人蛋白对大肠杆菌的致死作用.但是，其作用都弱于pLZZoA，表明尸1P基因 相对削弱了pZo和CytA之间的相互作用. 5.将以色列亚种pl夕和叮时基因的重组质粒转人大肠杆菌Mvl 190时，发现cy“基 因起始密码子区域缺失约30个碱基，导致CytA蛋白生物活性丧失，这种大肠杆菌细胞 使异源基因片段缺失的现象对异源基因表达异常分析具有指导意义。