论文部分内容阅读
目的肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前世界范围内位居第5位的致死性恶性肿瘤,也是近年来发病率上升最快的肿瘤之一。我国是肝癌的高发区,全球每年新发肝癌病例约56万,我国占1/2以上。目前HCC的常规筛查和诊断方法包括体格检查、影像学检查及血清甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)检测。AFP虽为诊断HCC的首选指标,但其敏感性和特异性均不理想。血清高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是近年来发现的一个新型HCC血清标志物。为评估GP73作为肝癌血清标志物的临床应用价值,本研究制备并鉴定了2株抗GP73重组蛋白的单克隆抗体(mAb),并应用该抗体建立了双抗体夹心ELISA(enzyme-linked immunoassay)方法用于人血清GP73的定量检测,进一步建立了基于GP73单克隆抗体的磁分离酶联免疫检测方法(magnetic enzyme-linked immunoassay,MEIA),并进行了初步评价。方法1.制备和纯化了GP73融合蛋白以及一对抗GP73的单克隆抗体(a-GP73mAb)。以SDS-PAGE电泳鉴定了GP73融合蛋白;以间接ELISA法检测抗体效价;并进行了抗体亚类鉴定;以Western blot及免疫组织化学鉴定抗体特异性。2.以a-GP73 mAb 8E7作为包被抗体包被96孔板,以HRP标记的a-GP73mAb 5A10作为检测抗体,通过棋盘滴定法确定最适工作浓度及反应条件;以纯化的GP73抗原为标准品建立标准曲线,建立双抗体夹心ELISA法,并应用新建立的ELISA方法测定103例正常人及119例肝癌患者的血清GP73含量。3.以a-gp73mab8e7作为包被抗体包被磁性颗粒,以hrp标记的a-gp73mab5a10作为检测抗体,确定其最佳工作浓度及反应条件后,以纯化的gp73抗原为标准品建立标准曲线,建立meia方法,并应用该方法对正常人、肝癌患者血清中的gp73含量进行了初步检测。结果1.成功制备并纯化了gp73蛋白,并以sds-page电泳进行了鉴定,其纯度高达90%。成功制备并纯化了两株抗体,分别命名为5a10和8e7,其免疫球蛋白亚类重链分别为igg1、igg2a,每株抗体效价均达1:243,000以上,westernblot和免疫组织化学结果显示,抗人gp73单克隆抗体能与gp73特异性结合。2.成功建立了可定量检测血清gp73含量的双抗体夹心elisa方法,该方法的最低检测限为1.56ng/ml。利用此法定量测定了103例正常人和119例肝癌患者血清,结果显示中肝癌组较正常对照组gp73含量明显升高(p<0.05)。3.成功建立了meia方法,此法通过增加免疫磁珠量可使最低检测限达到0.78ng/ml或更低。利用此法初步测定了正常人和肝癌患者的血清gp73,其血清检测结果跟双抗夹心elisa方法检测出来的结果一致,但与双抗体夹心elisa方法相比,磁酶免方法更便捷、省时。结论本研究成功诱导表达与纯化了gp73融合蛋白,以该融合蛋白为免疫原,成功制备及纯化得到2株高效价的抗人gp73mab,应用制备的gp73单抗建立了双抗体夹心elisa法和磁酶免方法,以此两种免疫方法检测了正常人和肝癌血清样本中gp73含量,结果表明肝癌患者血清gp73水平较正常人异常升高。进一步对两种免疫方法进行了检测性能评估,表明磁酶免方法比双抗体夹心elisa法更高效、便捷以及省时。我们的研究提示gp73分子在肝癌诊断中具有预警价值,有望成为肝癌早期诊断标志物,建立的基于gp73单抗的免疫检测方法未来有望在肝癌的临床检测、疾病筛查中进一步的推广应用。