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研究背景:目前临床上对骨修复材料的需求日益增长,组织工程骨相较于自体骨,具有来源广泛,可避免获取自体骨时对患者造成二次伤害,且尺寸可控等优势;相较于同种异体骨,组织工程骨成骨活性更高,骨修复能力更高。理想的移植材料应具有与自体骨相似的力学特征,并且能促进成骨细胞的分化,在缺损处作为新生骨、血管及软组织生长的临时支架。组织细胞外基质的主要成分为胶原蛋白,具有良好的生物相容性、生物降解性和无毒性,可以被许多细胞类型识别和粘附,已被广泛应用于组织工程支架材料和药物载体的研究中。天然有机高分子-明胶是胶原蛋白的水解形式,而单纯的明胶力学特性差,在体内过快地降解,达不到理想骨移植材料的标准,因此需要添加无机材料组成复合物满足强度需求,同时添加交联剂使其更稳定。硅基生物材料作为一种无机材料,具有较好生物相容性,因此研究很普遍,已被用于骨再生、血管生成、药物递送等相关研究。在研究的生物玻璃中已经证明硅能促进成骨细胞的成骨分化,但是单纯的二氧化硅不具有体外生物活性,浓度过高会抑制细胞的活性,需要添加体外矿化不可缺少的物质——钙。而如何将二者结合,同时结合物影响成骨作用如何还缺乏研究。明胶和硅基生物材料在物理、化学特性方面具有很强的互补性,利用目前的技术将明胶和硅基材料整合成复合材料,作为骨组织工程支架材料将可能具有一定的优势。同时,通过构建材料表面的组成和地质形貌会影响细胞的吸附、增殖和分化。复合材料的多孔结构有利于细胞与胞外离子、营养物质的交换,研究表明,当材料的孔隙率到达60%以上有利于骨再生。在纳米尺度表面粗糙度对成骨细胞有明显影响,具有促成骨作用,抑制成纤维细胞初始黏附。传统复合材料的组成相在微米尺度上相互作用,这可能导致溶解过程中两者不同的吸收速率,导致体内物质的不稳定性。若是组成相在纳米尺度上发生化学作用,形成Ⅱ类杂化材料,就能控制复合材料的降解率和机械性能等参数。研究目的为解决上述问题,本研究中采用非溶胶-凝胶法,将Si O2与Ca（OH）2制作成纳米尺寸的生物活性颗粒（Bioactive Particles,BPs）,采用Ⅱ类杂化的方式,使明胶与BPs通过共价键的方式形成稳定的连接。有机成分提高材料的生物相容性、增加材料的韧性、也作为无机纳米颗粒的附着物,无机成分提高材料的硬度,促进成骨分化;两种成分之间具有协同效应。通过调整两者的比例,优化材料的机械性能、生物活性以及物理表征,使其利于接种种子细胞而用于构建组织工程骨,发挥促成骨作用实现骨缺损的修复。研究方法1、材料的物理表征:采用溶胶—凝胶法制作纳米尺径的BPs,调整颗粒与明胶的比例,制作4种比例的材料—BPs/gel-0%、BPs/gel-20%、BPs/gel-50%、BPs/gel-100%。扫描电镜（Scanning Electron Microscope,SEM）检测材料孔径分布、颗粒分布和体外矿化的能力,接触角实验测试材料的亲水性,力学试验机检测材料的机械性能,电感耦合等离子体发射光谱仪（Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer ICP-OES）检测材料中钙和硅的释放。2、体外细胞实验:系列浓度梯度的BPs和4种复合材料分别与小鼠MSCs共培养,CCK-8检测BPs和复合材料对MSCs生长、黏附的影响,RT-PCR检测成骨诱导能力,共聚焦观察细胞在材料上的分布情况。3、体内骨缺损实验:将4种复合材料构建的组织工程骨植入骨缺损模型的C57小鼠体内,Micro-CT检测成骨情况,结合细胞实验以及材料的力学特征讨论实验结果。4、材料中BPs的成骨机制初步探究:将细胞接种到材料上,添加不同的通路抑制剂,检测BPS是否通过Wnt/β-catenin、P38MAPK、PI3K影响细胞成骨分化。实验结果:1、材料物理特征的实验结果显示,材料的物理特征同明胶与BPs的比例密切相关。SEM结果显示,材料的孔径随着BPs比列的升高孔径分布得越密集;在力学实验中,BPs能明显的改善材料的机械特性;接触角的实验结果则显示,明胶能增加材料的亲水性。2、BPs和复合材料分别同细胞共培养,利用CCK-8试剂在不同时间点检测BPs和复合材料对细胞的吸附、增殖情况,其结果显示,BPs含量越高,复合材料对细胞的吸附能力越强,但是对细胞的增殖无明显的影响。RT-PCR结果表明,浓度为4μg/ml的BPs能促进MSCs的成骨分化,浓度过高——超过4μg/ml可能会出现抑制分化的情况。3、体内成骨实验出现了与体外细胞实验不同的结果,Micro-CT显示BPs含量最高的一组—BPs/gel-100%支架能促进缺损处形成连续的呈闭合状态的新生皮质骨,并且CTVox数据表明,该组支架在骨缺损处形成的骨组织最丰富,说明BPs/gel-100%体内修复骨缺损能力最优。4、在成骨前期,BPs通过Wnt/β-catenin、P38MAPK和PI3K诱导RUNX2的表达,通过P38MAPK和PI3K诱导MSCs合成分泌ALP,并通过P38MAPK诱导MSCs合成COLⅠ。对于晚期成骨基因的表达,三组添加抑制剂的实验组与BPs组相比,均有抑制效果。基因OCN、OPN、OSX在BPs+LY249002（PI3K抑制剂）的作用下表达量最低;XAV-939（Wnt/β-catenin抑制剂）和SB203580（P38MAPK抑制剂）对OCN与OPN表达的抑制作用虽然显著但两者之间的差异无统计学意义;从抑制程度分析,三种抑制剂对OPN的作用效果明显,说明BPs诱导这该基因的表达主要是通过WNT/β-catenin、P38MAPK和PI3K,而对于OCN和OSX,BPs虽然能通过上述三条通路诱导成骨基因表达,但并不完全,提示可能还存在其他信号通路。结论:采用溶胶——凝胶法制作的纳米级BPs,在≤4μg/ml的浓度范围内能促进成骨分化,与明胶形成的复合材料,可以通过控制两者的比例改善材料的物理特征,体外和体内实验证明这种复合支架能明显促进成骨分化,修复骨损伤部位。机制实验则证明该支架主要是通过PI3K这条通路促进MSCs的成骨分化,其它两种通路作为辅助诱导通路。