目的:支气管哮喘是常见的呼吸系统慢性炎症性疾病,其发病是由于异常的免疫应答,从而引起呼气性呼吸困难、可逆性气流受限、气道粘液分泌增加、血嗜酸性粒细胞增多以及气道重塑等表现。哮喘的病因较为复杂,至今不甚明了,但发现受遗传、环境两大因素影响较大。众所周知空气中的灰尘、花粉、螨虫等致敏物质刺激哮喘的发作,亦有研究表明,生命早期环境微生物的暴露与哮喘、过敏性鼻炎等变应性疾病的发病率呈负相关。生命早期接触宠物的儿童,微生物暴露早且多,较生命早期未接触宠物的儿童哮喘发病率低;农场出生和生长的儿童较早地接触丰富的环境微生物,从而比城市内过度清洁环境生长的儿童哮喘发病率低;西方过度清洁的发达国家的居民较东欧和亚洲地区居民的哮喘发病率高,且近二十年来增长速度快。以上均表明环境微生物会影响哮喘等变应性疾病的发生,但环境微生物是通过何种途径、何种机制影响机体的免疫反应,至今尚未明确。肠道微生物群落又称肠道菌群,是指机体肠道内存在的各种微生物的总称。人体肠道内已知的微生物有500多种,其重量高达约1.5千克,与宿主共生,互惠互利,与肠粘膜、消化酶等形成一个动态稳定的微生态结构。机体的肠道微生物是在生命早期从母体、环境、饮食中逐步定植的,并参与到肠粘膜免疫及全身免疫系统的发育。环境微生物不仅影响生命早期肠道微生物的定植顺序及种类,还会影响成年机体的肠道微生物群落结构,迁徙的人群肠道微生物群落结构也会发生改变,所以考虑肠道微生物可能是环境微生物与机体免疫反应的中介。本研究就是通过研究致敏小鼠在不同环境下培养后肠道微生物群落结构的改变以及哮喘相关的免疫因子表达水平的变化,并初步探讨其发生机制。方法:1.将30只4周龄BALB/C小鼠随机分为3组,分别为哮喘组(A组)、干预组(B组)、对照组(C组),每组10只(雌、雄各5只),哮喘组及干预组小鼠均于第1、7、14天以含OVA 40μg、氢氧化铝4mg的生理盐水溶液200μl腹腔注射,并于第22-28天以卵清蛋白生理盐水溶液(体积分数5%、1天/次、30min/次)雾化吸入,对照组仅以生理盐水腹腔注射及雾化,观察各组小鼠雾化时的行为学变化。2.在同一地点同一时间收集富含腐质的土壤,与无菌颗粒垫料按一定比例混合制备微生物含量较丰富的垫料,用作干预组小鼠垫料;第28天雾化处理后将干预组小鼠转移至普通动物房,即微生物较丰富的环境内,而对照组、哮喘组小鼠仍在SPF动物房继续饲养;2周后采集各组小鼠的粪便,放于-80℃冰箱储存,并再次分别做上述雾化激发。3.最后一次雾化后的24小时内采集小鼠血液制备血清标本,采用ELISA法测定OVA-Ig E、IL-4、IFN-γ含量;采血后对小鼠进行支气管肺泡灌洗,灌洗液低速离心后制作细胞涂片,瑞氏染色并镜下分类计数。4.对粪便标本处理,提取菌群总DNA测定其浓度及OD值,对DNA样本进行16s DNA测序,在Linux系统下以QIIME软件对测序结果进行生物信息分析。结果:1.小鼠雾化激发时的行为学变化:经OVA致敏后小鼠出现焦虑、挠鼻、喘息、毛发凌乱、大小便失禁等行为学改变;干预组小鼠在经过微生物丰富的环境培养后,最后一次雾化激发时精神状态、喘息程度、焦虑程度均较未培养前有所减轻,较最后一次雾化时的哮喘组症状轻,对照组无异常变化。2.各组菌群差异性:(1)PCA坐标图示各组组间坐标位置接近,三组样本坐标位置相互离散。(2)系统发育树状图示三组的小鼠每组之间差异不明显,组别之间差异明显。(3)干预组小鼠肠道微生物OTU数显著高于哮喘组及对照组(p<0.05);哮喘组与对照组无明显差异(p>0.05)。(4)干预组小鼠厚壁菌门比例有所增高,显著高于多于哮喘组及对照组小鼠厚壁菌门比例(p<0.05);哮喘组于对照组无明显差异(p>0.05)。(5)干预组增加的厚壁菌门中以乳酸杆菌属增加为主,乳酸杆菌属比例明显高于另外两组p<0.05);哮喘组与对照组无明显差异(p>0.05)。3.干预组、哮喘组、对照组小鼠血清内OVA-Ig E含量分别为281.86±37.75(ng/ml)、972.44±120.53(ng/ml)、230.42±46.53(ng/ml),哮喘组与对照组,干预组与对照组,干预组与哮喘组OVA-Ig E含量明显差异,差异均具有统计学意义(p<0.05),干预组小鼠血清内0VA-Ig E含量显著低于哮喘组,却显著高于对照组,哮喘组小鼠血清内Ig E含量显著高于对照组。4.干预组、哮喘组、对照组小鼠血清内IL-4含量分别为224.61±28.73(pg/ml)、327.98±35.48(pg/ml)、160.41±27.67(pg/ml),哮喘组与对照组,干预组与对照组,干预组与哮喘组血清内IL-4含量不同,差异均具有统计学意义(p<0.05),干预组小鼠血清内IL-4表达水平显著低于哮喘组,哮喘组显著高于对照组,干预组明显高于对照组。5.实验结果显示干预组、哮喘组、对照组小鼠血清内IFN-γ含量分别为784.45.64±22.47(pg/ml)、363.59±28.14(pg/ml)、877.64±36.33(pg/ml),差异均具有统计学意义(p<0.05),干预组小鼠血清内IFN-γ表达水平显著高于哮喘组小鼠,哮喘组小鼠血清内IFN-γ表达水平显著低于对照组;干预组小鼠血清内IFN-γ表达水平明显低于对照组。6.实验结果示干预组、哮喘组、对照小鼠BALF内白细胞总数分别为54.24±5.05(×104ml-1)、121.23±6.04(×104ml-1)、30.41±5.33(×104ml-1),嗜酸性粒细胞总数分别为1.75±0.55(×104ml-1)、13.02±3.51(×104ml-1)、0.21±0.07(×104ml-1),数据差异均具有统计学意义(p<0.05),哮喘组小鼠BALF内白细胞、嗜酸性粒细细胞数显著高于对照组和干预组,干预组小鼠BALF内白细胞、嗜酸性粒细细胞数显著高于对照组,低于哮喘组。结论:1.增加环境微生物的多样性和丰度,可以提高小鼠肠道微生物的多样性和丰度,改变其群结结构及菌属比例。2.增加环境微生物的多样性和丰度,可影响小鼠的哮喘相关免疫反应,抑制血清内炎性因子的表达,提高血清IFN-γ的含量,降低气道分泌物中炎性细胞数量,减少或控制其哮喘的发作。