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研究背景缺血性心脏病,又名冠状动脉粥样硬化性心脏病,是当今世界死亡人数最多的疾病,严重危害人类健康。当冠脉粥样硬化斑块破裂时,可引起血小板激活,进而形成血栓,导致一系列严重的临床症状,甚至死亡。血小板P2Y12受体在血小板激活过程中发挥着重要作用,其天然配体是二磷酸腺苷(ADP)。目前以P2Y12受体为靶点的抗血小板药物氯吡格雷疗效确切、耐受性好,在临床应用广泛。但是由于氯吡格雷是前药,在体内需经肝脏P450酶系两步氧化,生成活性代谢产物,因此存在如下缺陷:起效慢(约在服药后6 h)、消除时间长(5～7 d)和氯吡格雷抵抗现象等。以氯吡格雷的第一步代谢产物硫内酯为先导化合物,研究者设计并合成了一系列2-羟基四氢噻吩并吡啶衍生物作为前药。通过初步筛选,化合物3(即维卡格雷)具有良好的抑制血小板聚集活性。本研究围绕维卡格雷,评价其在多种动物模型中的抗血栓活性,并对其20个代谢产物进行了初步活性研究。实验方法第一部分抗血小板化合物筛选以1%羧甲基纤维素钠(1%CMC-Na)分别将化合物制成混悬液,Wistar大鼠灌胃给药(3mg/kg),2小时后以20%乌拉坦麻醉后,经腹主动脉取血,3.8%枸椽酸钠抗凝(1:9),离心制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP),以ADP为诱导剂(终浓度1.2 μM),于血小板聚集仪上观察血小板聚集率,并计算药物对血小板聚集的抑制率。第二部分维卡格雷抗血小板药效学评价1.时效关系研究:以氯吡格雷(10mg/kg,30mg/kg)、普拉格雷(1mg/kg,3mg/kg)为阳性对照组,1%CMC-Na为阴性对照组,维卡格雷(1mg/kg,3mg/kg)为实验组,Wistar大鼠灌胃给药,分别于灌胃后0.5h,1h,2h,3h,4h,12h腹腔注射20%乌拉坦麻醉,经腹主动脉取血,3.8%枸橼酸钠抗凝(1:9),离心制备PRP和PPP,测定ADP(终浓度1.2μM)诱导的大鼠血小板聚集率,统计药物在不同时间点对血小板聚集的抑制率。2.量效关系研究:以氯吡格雷(1mg/kg,3mg/kg,10mg/kg,30mg/kg)、普拉格雷(0.1mg/kg,0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg)为阳性对照组,1%CMC-Na为阴性对照组,维卡格雷(0.1mg/kg,0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg)为实验组,Wistar大鼠灌胃给药,3小时后腹腔注射20%乌拉坦麻醉,经腹主动脉取血,3.8%枸橼酸钠抗凝(1:9),离心制备PRP和PPP,以ADP为诱导剂(终浓度1.2μM),于血小板聚集仪上观察血小板聚集率,并统计不同剂量药物对血小板聚集的抑制率。3.维卡格雷对电刺激大鼠颈总动脉血栓生成的影响:以氯吡格雷(1Omg/kg)、普拉格雷(3mg/kg)为阳性对照,1%CMC-Na为阴性对照,维卡格雷(0.1 mg/kg,0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg)为实验组,Wistar大鼠连续灌胃3天,末次给药后3小时,以1.5mA直流电刺激大鼠颈总动脉7分钟,测定各组大鼠的血管闭塞时间。4.维卡格雷对大鼠动静脉旁路血栓生成的影响:以氯吡格雷(1Omg/kg)、普拉格雷(3mg/kg)为阳性对照,1%CMC-Na为阴性对照,维卡格雷(0.1mg/kg,0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg)为实验组,Wistar大鼠连续灌胃给药3天,末次给药3小时后,分离大鼠左侧颈总动脉及右侧颈外静脉,建立动静脉旁路,测定旁路内生成血栓的重量。5.维卡格雷对小鼠尾出血时间的影响:以氯吡格雷(16mg/kg)、普拉格雷(1.6mg/kg)为阳性对照,1%CMC-Na为阴性对照,维卡格雷(0.16mg/kg,0.48mg/kg,1.6mg/kg)为实验组,昆明小鼠连续灌胃给药3天,末次给药2小时后,剪去小鼠尾端2～3mm,立即置于37℃生理盐水中,以血流停止时间为指标,测定小鼠尾尖出血时间。6.维卡格雷对花生四烯酸诱导小鼠肺栓塞死亡的影响:小鼠随机分为溶媒对照组(1%CMC-Na),模型组(1%CMC-Na,0.1mol/LNa2CO3),维卡格雷组(2.5mg/kg,,5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg),普拉格雷组(10mg/kg)和氯吡格雷(1OOmg/kg)组。连续灌胃给药3天,末次给药2小时后,溶媒对照组及实验组尾静脉注射花生四烯酸(75mg/kg),模型组尾静脉注射溶剂Na2C03(0.1M),观察3分钟内小鼠的死亡数量。第三部分维卡格雷代谢物抗血小板活性测定以1%CMC-Na分别将维卡格雷各代谢物制成混悬液,Wistar大鼠灌胃给药(3mg/kg),2小时后腹腔注射20%乌拉坦麻醉后,经腹主动脉取血,3.8%枸橼酸钠抗凝(1:9),离心制备PRP和PPP,以ADP为诱导剂(终浓度1.2μM),于血小板聚集仪上观察血小板聚集率,并计算各化合物对血小板聚集的抑制率。实验结果第一部分抗血小板化合物筛选在28个化合物中,有14个具有明显的抗血小板聚集活性,其中化合物3(即维卡格雷)抗血小板聚集活性最强。第二部分维卡格雷抗血小板药效学评价1.时效关系研究:维卡格雷对ADP诱导大鼠血小板聚集有明显的抑制作用,并呈现时间依赖关系。各药随着剂量增加,效应增强。药后1小时开始出现作用,随着时间的延长,作用加强,药后1小时至4小时作用最强。12小时作用开始减弱。2.量效关系研究:维卡格雷、氯吡格雷、普拉格雷对ADP诱导大鼠血小板聚集有明显的抑制作用,并呈现明显的剂量依赖关系。其IC50分别为:维卡格雷2.03mg/kg;普拉格雷 1.91mg/kg;氯吡格雷 15.03mg/kg。3.维卡格雷对电刺激大鼠颈总动脉血栓生成的影响:维卡格雷(0.3mg/kg,Img/kg,3mg/kg)可明显延长血管阻塞时间,提示维卡格雷对电刺激大鼠颈总动静血栓形成具有抑制作用。4.维卡格雷对大鼠动静脉旁路血栓生成的影响:维卡格雷(0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg)可明显降低大鼠动静脉旁路血栓重量,且呈剂量依赖关系。说明维卡格雷对大鼠动静脉旁路血栓形成具有抑制作用。其抑制大鼠动静脉旁路血栓形成的IC50为0.56mg/kg。5.维卡格雷对小鼠尾出血时间的影响:维卡格雷(0.48mg/kg,1.6mg/kg)可明显延长小鼠尾出血时间,提示维卡格雷可明显抑制血小板的止血功能。6.维卡格雷对花生四烯酸诱导小鼠肺栓塞死亡的影响:维卡格雷组(2.5mg/kg,5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg),普拉格雷(10mg/kg)和氯吡格雷(100mg/kg)组均不能明显减少小鼠死亡率,提示该剂量下维卡格雷等药物对花生四烯酸所致小鼠肺栓塞死亡率无影响。第三部分维卡格雷代谢物抗血小板活性测定在20个代谢物样本中,有7个能够明显抑制血小板聚集。提示部分维卡格雷代谢物可能具有口服抗血小板聚集活性。结论维卡格雷有明显的抗血小板聚集作用,大鼠口服给药后1小时即有明显作用,1～4小时之间维持较高的抗血小板活性。维卡格雷抑制正常大鼠血小板聚集的IC50值为2.03mg/kg,明显优于氯吡格雷(15.03mg/kg),与普拉格雷(1.91mg/kg)类似。维卡格雷可以抑制多种动物模型中的血栓形成,抑制血小板的止血功能,作用强度接近同剂量普拉格雷。维卡格雷对花生四烯酸所致小鼠肺栓塞未见明显影响,可能与其主要作用于ADP受体,而对TXA2受体无影响的作用机制有关。在20个待筛选的维卡格雷代谢物中,有7个可明显抑制血小板聚集。