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蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质修饰方法,它将糖分子共价交联到蛋白质分子,同时,产物的功能性质也因此而改变。蛋白质的糖基化修饰,可以扩大蛋白质在食品加工中的应用。酪蛋白和大豆蛋白在食品加工中占重要地位,糖基化修饰可以进一步改善它们的功能性质,可以获得更好的应用效果。先期研究已经验证：转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13)可以催化酪蛋白及大豆蛋白与氨基葡萄糖之间发生糖基化交联反应,并证实修饰产物具有更好的功能性质。在本课题中,将对这一试验结果进行扩展研究,将脱酰胺与酶法糖基化交联修饰结合,研究脱酰胺处理对修饰产物功能性质的影响作用。对蛋白质进行部分脱酰胺预处理,制得两种具有不同脱酰胺度的蛋白质,再按照固定的摩尔比例添加氨基葡萄糖,在其他条件相同的情况下,利用转谷氨酰胺酶的作用发生糖基化和交联反应。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法确认交联反应和糖基化反应,并利用高效液相色谱(HPLC)测定氨基葡萄糖结合量；通过测定样品中游离氨基含量间接分析产物中蛋白质的自身交联情况；通过圆二色谱(CD)测定产物二级结构变化情况,通过红外光谱(FT-IR)法测定分析产物侧链结构中特殊的化学基团,并进一步证实糖基化反应的发生。通过测定原料蛋白及其修饰产物的水合性质、流变性质、体外消化性等,确定脱酰胺处理对修饰产物功能性质的影响。主要研究结果如下：1.制备脱酰胺及转谷氨酰胺酶糖基化交联蛋白质制备两种脱酰胺度的酪蛋白,测得脱酰胺度分别为16.6%和28.1%。依照蛋白质中酰胺基团含量,以固定的摩尔比例添加氨基葡萄糖。在最优条件下,使其发生酶法糖基化交联反应(本研究优化了酪蛋白糖基化交联反应的条件,将酪蛋白浓度由30g L-1提高到50 g L-1)。利用HPLC法测得糖基化交联酪蛋白的氨基葡萄糖结合量为12.6 g kg-1蛋白质,两种糖基化交联脱酰胺酪蛋白的氨基葡萄糖结合量分别为9.8 g kg-1和6.9 g kg-1蛋白质,证明糖基化反应的发生。酪蛋白发生糖基化交联反应后,游离氨基含量明显降低(0.61 mol kg-1蛋白质vs.0.51 mol kg’蛋白质),而糖基化交联脱酰胺酪蛋白游离氨基含量为0.54-0.56 mol kg-1蛋白质。游离氨基结果证明交联反应发生,但糖基化脱酰胺酪蛋白的交联程度小于糖基化交联酪蛋白。制备两种脱酰胺度的大豆蛋白,脱酰胺度分别为12.2%和27.4%。依照蛋白质中酰胺基团含量,将原料大豆蛋白和两种脱酰胺大豆蛋白,以固定的摩尔比例添加氨基葡萄糖。在最优条件下,使其发生酶法糖基化交联反应。利用HPLC法测得糖基化交联大豆蛋白的氨基葡萄糖结合量为19.7 g kg。蛋白质,两种糖基化交联脱酰胺大豆蛋白的氨基葡萄糖结合量分别为12.0 gkg-1蛋白质和4.4 gkg-1蛋白质,证明糖基化反应的发生。大豆蛋白发生糖基化交联反应后,游离氨基含量明显降低(0.49 mol kg-1蛋白质vs.0.36 mol kg-1蛋白质),糖基化交联脱酰胺大豆蛋白的游离氨基含量为0.38 mol kg-1蛋白质。证明交联反应发生。2.蛋白质的结构发生变化SDS-PAGE结果证实,蛋白质修饰过程中发生了糖基化反应和蛋白质交联反应。FT-IR分析结果显示,修饰产物的特征吸收峰增大,表明氨基葡萄糖以共价连接的方式连接于蛋白质底物分子。CD分析结果显示,蛋白质发生糖基化交联反应后,它们的二级结构发生变化。糖基化交联反应使酪蛋白糖基化交联修饰产物的二级结构变得更加有序(如无规则卷曲结构比例降低,而α-螺旋、β-折叠、β-转角的比例增加)；同时,是大豆蛋白的糖基化交联修饰产物的二级结构变得更加无序(如α-螺旋和β-折叠的比例减少,而无规则卷曲结构比例增加)。3.糖基化交联修饰产物的功能性质改变与原料蛋白相比,脱酰胺蛋白的溶解性增加,且脱酰胺度越大溶解度增加幅度越大。与酪蛋白相比,糖基化交联脱酰胺酪蛋白的溶解性增加；糖基化交联脱酰胺酪蛋白1和糖基化交联脱酰胺酪蛋白2吸水性高4.4和3.0倍,吸油性高1.5和1.2倍；乳化活性低7.3%和1.6%,乳化稳定性高10.8%和4.6%,体外消化能力略有降低。与糖基化交联酪蛋白相比,糖基化交联脱酰胺酪蛋白的溶解性较低；糖基化交联脱酰胺酪蛋白1和糖基化交联酪蛋白2的吸水性分别比糖基化交联酪蛋白低8.6%和37.0%,吸油性低25.0%和38.6%；乳化活性高7.8%和14.4%,乳化稳定性低4.4%和9.7%,体外消化能力增加。脱酰胺酪蛋白的表面疏水性低于酪蛋白。糖基化交联酪蛋白和糖基化交联脱酰胺酪蛋白的表面疏水性明显低于酪蛋白和脱酰胺酪蛋白,糖基化交联酪蛋白的表面疏水性最小。与原料大豆蛋白相比,糖基化交联脱酰胺大豆蛋白的溶解性较低；糖基化交联大豆蛋白1和糖基化交联大豆蛋白2的吸水性高41.5%和32.3%,吸油性高1.4和1.0倍；糖基化交联大豆蛋白1的乳化活性低7.2%,糖基化交联大豆蛋白2的乳化稳定性变化不显著,糖基化交联大豆蛋白l的乳化稳定性高16.1%和2.1%；表面疏水性低13.8%和30.1%；体外消化能力较低。与糖基化交联大豆蛋白相比,糖基化交联脱酰胺大豆蛋白的溶解性较高；糖基化交联大豆蛋白1和糖基化交联大豆蛋白2的吸水性低15.9%和37.5%,吸油性低23.3%和38.4%；乳化活性高5.7%和14.1%,乳化稳定性低17.2%和6.2%；表面疏水性高41.5%和74.6%；体外消化能力略有提升。酸凝胶TPA分析结果显示,与原料蛋白相比,糖基化交联蛋白质及糖基化交联脱酰胺蛋白质所形成酸凝胶的硬度、黏附性、胶着性较高。酪蛋白形成酸凝胶的时间扫描结果显示,糖基化交联酪蛋白的凝胶时间明显短于酪蛋白,糖基化交联脱酰胺酪蛋白的凝胶时间长于糖基化酪蛋白。糖基化交联明显改善流变学性质。糖基化交联酪蛋白分散液的表观黏度、弹性模量和黏性模量显著高于原料酪蛋白,而糖基化交联脱酰胺酪蛋白的这些性质则低于糖基化交联酪蛋白。