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目的和意义：以人微血管内皮细胞株HMEC-1为研究对象,探讨缺氧条件下血府逐瘀汤含药血清不同浓度(1.25%,2.5%,5%)与血管新生活动中EphrinB2和EphB4的关系。从细胞水平、分子水平探讨血府逐瘀汤对EphB4/EphrinB2信号的影响,从而为血府逐瘀汤调控血管新生的机制和临床应用提供实验佐证。方法：1.制备大鼠血府逐瘀汤含药血清和空白血清。SPF级SD雄性大鼠60只,体重(230±10)g,随机分为药物组和空白对照组2组,每组30只,由校实验动物中心饲养。参照人和动物间用药剂量的换算,药物组以人口服剂量12倍,即0.41 g/kg灌胃,生理盐水组以等量生理盐水灌胃,血府逐瘀胶囊按剂量溶于生理盐水中,连续灌胃7天,2次／天,于第8天灌胃后两小时注射戊巴比妥钠(2%浓度,0.75 ml/kg)腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,4000 r/min离心30 min后分离血清,56℃℃,30 min水浴灭活,无菌室超净工作台上用0.221μm的针式过滤器过滤除菌,分装,置于-20℃℃冰箱保存备用。2.常规培养HMEC-1细胞。将11.6g MCDB-131干粉培养基和1.18g碳酸氢钠完全溶解于超纯水中,定容到1000 ml,调整pH值到7.2-7.4,4℃冰箱过夜,次日过滤除菌,分装备用。在配制好的培养基原液中按比例加入EGF,氢化可的松和胎牛血清,配制成完全培养基(MCDB-131培养液、EGF、氢化可的松、胎牛血清按88：1：1：10比例配置),4℃C保存备用。在培养基原液中加入胎牛血清制成浓度5%的实验用培基,实验中用于配制不同浓度(1.25%、2.5%、5%)的含药血清。3.管腔形成实验。同血清含量的药物组和空白组缺氧培氧箱(02浓度1%)培养24h、48h和72h后,将细胞培养皿取出,将细胞用胰酶消化下来,根据实验需要计数,按一定密度稀释并接种于预制的基质胶上,继续培养5小时,倒置显微镜高倍镜下(200×)随机选取视野拍照,计算管腔形成数量,统计学比较相同血清含量条件下药物组和空白组的差异。4.实时荧光定量PCR技术检测EphB4和EphrinB2基因的转录。Trizol法提取总RNA,反转录成cDNA。根据Genbank发布的基因序列,应用Primer 5软件设计靶基因和β-actin的引物。检测不同时间点基因表达情况,用2-△△CT相对定量法进行评价。5.免疫印迹法检测EphB4/EphrinB2和磷酸化EphrinB2的表达。提取细胞总蛋白,用BCA蛋白定量法检测蛋白浓度确定蛋白上样量。对提取的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离,湿转法将蛋白印迹到PVDF膜上。封闭液封闭,一抗4℃℃孵育过夜,二抗孵育并检测条带,比较表达差异。结果：1.管腔形成实验：与相同血清含量的空白血清组比较,24 h作用时间段2.5%和5%含药血清浓度表现为促进血管形成作用,48 h作用时间段只有5%含药血清组对管腔的形成数量起到促进作用。而72 h三个浓度含药血清组对管腔形成均无促进作用。2.实时荧光定量PCR：选取浓度为2.5%的含药血清组干预6h、12h、24h、48h, EphrinB2在含药血清干预6 h、12 h后皆上调表达(P<0.01), EphB4在干预12h后下调表达。而继续干预24h和48h后,基因转录水平与同等血清含量空白血清组比较,二者都没有统计学差异。3.Western Blot蛋白印迹：含药血清组EphrinB2蛋白表达量在9h和24h明显高于空白对照组(P<0.05)。EphB4蛋白表达量在12h低于空白对照组(P<0.05)。EphrinB2磷酸化蛋白24h上调表达(P<0.01)。结论：缺氧条件下血府逐瘀汤具有显著的促血管新生作用,该作用过程与EphB4/EphrinB2信号通路有关。