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目的：
MORC2是MORC蛋白家族的一个成员,分子量为117kD,编码970个氨基酸,主要定位在细胞核内。MORC家族蛋白含有CW型锌指结构域、线圈结构域及脯氨酸富集区。MORC2的表达比较广泛,并且在睾丸,卵巢和脑组织中有着很高的转录水平。它除了与DNA结合外,还参与蛋白质.蛋白质相互作用,调节基因转录,目前对MORC家族蛋白尤其是MORC2研究较少。
PKA,即蛋白激酶A,是最早被发现且迄今为止研究最为广泛的激酶之一,几乎在所有组织细胞内都有分布,参与很多信号通路并有相当广泛的底物选择性。PKA全酶是由两个催化亚基(C)与两个调节亚基(R)组成的四聚体,催化亚基有3种亚型(Cα,Cβ和Cγ),调节亚基有四种亚型(RⅠα、RⅠβ、RⅡα和RⅡβ)。PKA全酶通常是以无活性形式存在的,当第二信使3’,5’-环腺苷酸(cAMP)结合到调节亚基上时,释放出具有活性的催化亚基,PKA被激活从而磷酸化下游底物的丝氨酸或苏氨酸残基,进一步影响到相关基因的表达。有研究表明,PKA与肿瘤的侵袭转移及预后等生物学特性有关,它可以通过与PKA锚定蛋白相互作用从而磷酸化特定的底物发挥生物学功能。
PKA锚定蛋白,即AKAPs,是一类结构不同.功能相关的蛋白质,它们可与PKA的调节亚基结合通过形成PKA-AKAP复合体将PKA锚定到特定的亚细胞结构,将PKA定位于其特异性底物的附近,使其对底物进行磷酸化或去磷酸化,发挥生物学作用,其功能与许多疾病相关。到目前为止,已发现超过50个成员。目前有研究表明,AKAPs与肿瘤的发生和发展相关,例如,AKAP12是一种肿瘤抑制因子,在抑制肿瘤的发生和转移过程中扮演重要角色,在前列腺癌、骨肉瘤、纤维肉瘤、肺癌等多种人类肿瘤中AKAP12表达下调或缺失;AKAP13则是一种肿瘤诱发因子,通过鸟嘌呤核苷酸交换激活Rho信号通路,产生有活性的GTP酶,诱导肿瘤的发生;另外有报道表明AKAP9也与肿瘤的产生有关。但对于AKAPs与胃癌关系的目前还没有报导,胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,因此对胃癌发病机制及其诊断治疗的研究是目前我国肿瘤研究的一个重要课题。
本研究是在王桂玲导师前期工作的基础上,以胃癌细胞系为研究对象,进一步证实MORC2既能被PKA磷酸化又能做为一种新的AKAP与PKA的调节亚基相互作用介导胃癌细胞的迁移,为进一步探讨MORC2在胃癌中的作用提供新的思路和线索。
方法：
1、体外激酶实验检测PKA磷酸化MORC2并确定其磷酸化位点。
2、利用MORC2677丝氨酸位点的磷酸化抗体,通过Western Blot进一步验证PKA在体内磷酸化MORC2。
3、GST-pulldown实验证实MORC2与PKA的调节亚基RⅡβ在体外相互作用。
4、免疫共沉淀实验进一步体内验证MORC2与PKARⅡβ的相互作用;通过磷酸酶处理,检测MORC2的磷酸化是否影响与PKARⅡβ的相互作用。
5、共聚焦免疫荧光实验检测MORC2与PKARⅡβ在细胞内共定位。
6、Transwell实验检测MORC2对胃癌SGC-7901细胞迁移能力的影响。
通过G418筛选,我们分别建立了稳定转染pcDNA3.1-hisA-vector,pcDNA3.1-hisA-MORC2-WT以及pcDNA3.1-hisA-MORC2-S677A的胃癌SGC-7901细胞系;慢病毒感染方法,建立shMORC2-LV稳定沉默MORC2胃癌SGC-7901的细胞系。
当MORC2过表达或沉默时,transwell检测MORC2和PKARⅡβ对胃癌SGC-7901细胞迁移能力的影响。
结果：
1、体外激酶实验证实PKA磷酸化MORC2的677位丝氨酸位点。
2、Western blot实验进一步体内证实PKA磷酸化MORC2的677位丝氨酸。
3、体外GST-pulldown实验证实MORC2脯氨酸富集区的657-781AA与PKA调节亚基RⅡβ结合。
4、免疫共沉淀实验体内进一步证实MORC2与PKARⅡβ相互作用;当加入碱性磷酸酶处理时发现,MORC2的磷酸化能促进其与PKARⅡβ的结合。
5、共聚焦免疫荧光实验证实MORC2与PKARⅡβ共定位于胞浆。
6、Transwell实验证实当MORC2过表达时,促进SCG-7901细胞迁移;当MORC2被沉默时,抑制SGC-7901细胞迁移。与单独过表达MORC2相比,当MORC2和PKARⅡβ都过表达时,SCG-7901细胞迁移率受到抑制。
结论：
1、PKA磷酸化MORC2的677位丝氨酸。
2、MORC2能与PKA调节亚基RⅡβ结合,是一个新的AKAP且MORC2的磷酸化能促进其与PKARⅡβ的结合。
3、MORC2的过表达可以促进胃癌SGC-7901细胞的迁移,而PKARⅡβ能抑制这种作用。