生物纳米孔传感器可以实现微观尺度上的单分子检测,在单分子分析、单分子化学反应研究等领域具有独特价值和显著优越性。α-溶血素(α-Hemolysin,αHL)是金黄色葡萄球菌分泌的一种水溶性蛋白单体,在双脂膜上可组装成结构稳定的七聚体蛋白纳米孔,是理想的纳米检测器件。天然的α-溶血素纳米孔是一个开放式非选择性通道,但该纳米管最窄处仅为1.4纳米,孔径大小和通道的非选择性极大限制了它的检测范围和灵敏度。对α-溶血素进行基因工程突变和定向化学修饰,可改变七聚体纳米孔腔内正负电荷数比例,孔径大小,结构特性等。半胱氨酸因具备巯基而广泛被作为定向突变的氨基酸,可连接特定配体,改变纳米孔空间结构或功能,拓展α-溶血素纳米孔在单分子检测方向的应用。本研究首先分别将α-溶血素多个不同位点氨基酸定向突变为半胱氨酸残基,研究这些位点对于蛋白活性和组装成七聚体能力的影响。其次,研究了 α-溶血素单体蛋白利用DPhPC单层膜进行纳米孔的组装。α-溶血素单体蛋白的组装利用生物双分子层膜进行,但组装机理的研究仍然不尽人意,该方法为单体蛋白的组装提供了新思路。该项目的完成将极大拓展α-溶血素纳米通道的应用,并对膜蛋白的可控组装和功能集成化提供有益的探索,也将为纳米检测在各领域的广泛应用提供强有力的技术支持。本论文包括以下两部分:1.α-溶血素半胱氨酸突变体纳米孔的制备。本实验探索了 αHL的制备方法并利用定点突变将αHL多个位点突变为半胱氨酸残基,制备了不同性能的蛋白纳米孔作为检测器。将纳米孔 Top 端 17、18 位,Vestibule 端 103、105 位,Constriction 端 113 位,β-barre端117、121位,Bottom端128、129位的氨基酸成功进行单个半胱氨酸定向突变。通过细菌体内表达和超滤离心管截留纯化法对单体蛋白进行制备和纯化,比较不同突变体蛋白活性和组装能力的差异性,制备了具有半胱氨酸残基的七聚体纳米孔。结果表明103位和105位突变为半胱氨酸后,溶血活性降低并限制了纳米孔的组装。2.α-溶血素单体蛋白在单层膜上的组装情况。本实验利用DPhPC单层膜制备了七聚体纳米孔,并对单层膜组装条件进行了探索,比较了野生型αHL单体蛋白在双层膜和单层膜上组装的两种七聚体(αHL7)D和(αHL7)R的热稳定性以及打孔能力的差异性。结果表明两种蛋白在65℃以下都比较稳定,当温度升高时,七聚体开始分解为单体蛋白,双层膜与单层膜上组装形成的七聚体纳米孔在单通道检测方面没有差异,说明利用单层膜组装纳米孔的方法是可行的。