本论文主体内容分为两部分。第一部分为靶向CD19嵌合抗原受体T细胞联合抗PD-1单抗治疗CD19阳性B细胞淋巴瘤的临床研究。第二部分为Luc/GFP表达的AML细胞系和AML NSG小鼠模型的构建。目的:一、研究CD19 CART和抗PD-1抗体(nivolumab)联合治疗对于复发难治B细胞淋巴瘤的安全性,同时评估二者联合应用的有效性。二、构建稳定表达荧光素酶/绿色荧光蛋白的MOLM-13细胞(MOLM13-Luc+GFP+细胞),并建立荧光素酶标记的急性髓细胞白血病小鼠模型,用以评估针对急性髓细胞白血病的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的抗肿瘤效应。内容:一、收集天津市第一中心医院血液科接受CD19 CAR-T联合抗PD-1抗体治疗的复发难治B细胞淋巴瘤患者资料并进行随访,分析该治疗的安全性和可行性,并初步评估其有效性。二、利用分子生物学方法构建出过表达荧光素酶/绿色荧光蛋白的慢病毒载体并进行病毒包装,转染MOLM-13及筛选出荧光素酶/绿色荧光蛋白强阳性的MOLM13-LUC+GFP+细胞,并利用此细胞系建立AML NSG小鼠模型。以此细胞系和小鼠模型验证CD123CAR-T抗肿瘤的功能。方法:一、回顾性分析2017年5月到2018年11月于天津市第一中心医院血液科的接受CD19CAR-T联合抗PD-1抗体治疗的11例复发难治的B细胞淋巴瘤的副作用及临床疗效。二、构建表达荧光素酶/绿色荧光蛋白AML的细胞系和NSG小鼠模型:1.构建慢病毒载体:在慢病毒载体含有嘌呤霉素抗性及绿色荧光蛋白基因的基础上,通过酶切及PCR的方法在载体中插入目的基因荧光素酶,构建出过表达荧光素酶/绿色荧光蛋白的慢病毒载体。2.病毒包装:培养HEK293T进行病毒包装得到相应的慢病毒并利用梯度稀释法检测得到的慢病毒的滴度。3.病毒转染及荧光素酶/绿色荧光蛋白强阳性细胞筛选及鉴定(1)用慢病毒转导急性髓细胞白血病细胞系MOLM-13并用嘌呤霉素进行筛选得到稳定表达荧光素酶/绿色荧光蛋白的MOLM-13细胞。(2)用嘌呤霉素筛选后纯度较高的阳性细胞用有限稀释法进行单克隆培养,通过流式检测选取GFP的荧光强度最强的单克隆,并命名为MOLM13-LUC+GFP+细胞。(3)通过细胞计数观察MOLM13-LUC+GFP+细胞与母细胞MOLM-13在生长特性方面的差异。通过梯度稀释法检测MOLM13-LUC+GFP+细胞荧光素酶的活性。收集不同代数的MOLM13-LUC+GFP+细胞检测其Luc和GFP表达的稳定性。(4)分别选取MOLM13-LUC+GFP+细胞分别与CD123CAR-T和未转染的T细胞共同孵育,通过流式绝对计数检测GFP阳性细胞数以验证效应细胞对靶细胞的杀伤作用。4.AML NSG小鼠模型建立以MOLM13-LUC+GFP+细胞对NSG小鼠进行尾静脉注射,通过活体成像对白血病细胞在体内的生长及扩散进行检测。5.CD123CAR-T抗肿瘤功能验证将构建成功的小鼠模型随机分为两组,实验组给予CD123CAR-T治疗,对照组给予未转染的T细胞,治疗后定期进行活体成像,记录生存期。结果:1.11例患者中9例发生CRS,其中3例1级CRS,6例2级CRS,经及时的对症治疗均可缓解。所有患者接受抗PD-1抗体(纳武单抗,3mg/kg体重)输注后均未观察到严重的免疫介导的副反应。2.本研究CD19 CAR-T联合抗PD-1抗体治疗总体有效率为81.81%(9/11,81.81%),其中5例获得完全缓解(5/11,45.45%),4例部分缓解(4/11,36.36%),其余2例治疗无效。3.患者外周血T细胞上的PD-1的表达可以被抗PD-1抗体抑制。4.构建出测序结果完全吻合的慢病毒表达载体。5.制备了足量、质控稳定的荧光素酶/绿色荧光蛋白过表达的慢病毒。6.培养出稳定高表达荧光素酶/绿色荧光蛋白的MOLM13-LUC+GFP+细胞系,在生长特性方面与母细胞MOLM-13无明显差异。并且经体外实验验证,CD123CAR-T相比于未转染的T细胞可有效清除GFP阳性细胞。7.通过尾静脉注射MOLM13-LUC+GFP+细胞构建了AML NSG小鼠模型。8.在成功建立的AML小鼠模型中,实验组在给予CD123CAR-T细胞治疗后,经活体成像,其肿瘤负荷仍逐渐增加,但增长速度明显低于对照组。实验组生存期明显长于对照组。结论:1.一定剂量的CD19 CAR-T(5–11×106 cells/kg)序贯抗PD-1抗体纳武抗体(3mg/kg)输注治疗B细胞淋巴瘤的毒性是安全可控的。2.CD19 CAR-T联合抗PD-1抗体治疗能否改善复发难治性非霍奇金淋巴瘤患者预后仍需扩大样本进行更深入的研究。3.建立了稳定表达表达荧光素酶/绿色荧光蛋白的急性髓细胞白血病细胞系及相应的NSG小鼠模型,为针对AML的生物靶向治疗的设计及治疗方案的优化提供了物质基础。