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苏云金芽胞杆菌(Bt)是世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂,在多种害虫的综合防治中发挥了重要作用。作为一种重要的昆虫病原菌,Bt可以产生许多毒力因子帮助其侵入宿主,从而抵抗不利环境并生长繁殖,这些毒力因子包括许多降解酶类和毒素,如磷脂酶C、溶血素、蛋白酶、胶原酶等。本文主要研究了苏云金芽胞杆菌来源的胶原酶ColB1在Bt感染昆虫中的功能作用。1.colB1基因的克隆、表达及活性鉴定从YBT-1520菌株中克隆得到colB1基因,其核苷酸长度2898 bp,编码965个氨基酸,预测分子量110 kDa。将colB1基因克隆到pET28a载体,并在大肠杆菌中超量表达。纯化的ColB1蛋白能在明胶平板上产生水解圈,以Ⅰ型胶原为底物,采用茚三酮显色法测得该蛋白的酶活力为27.2 U/mL,比活力为2709 U/mg。2.ColB1蛋白与Cry1Ac复配能增强Cry1Ac对棉铃虫的杀虫活性以棉铃虫幼虫为供试昆虫,采用混合饲料法和表面涂布法测定了ColB1蛋白对杀虫晶体蛋白Cry1Ac的增效作用。混合饲料法生测结果表明,高浓度的ColB1蛋白能增强Cry1Ac的杀虫活性。表面涂布法测定结果显示,混合ColB1蛋白浓度组的死亡率均大于等于单独Cry1Ac浓度组,且其增效作用更明显。3.BMB171中ColB1在Bt感染昆虫中的功能研究序列比对发现,colB1基因与已公布的苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171基因组中BMB171_C0475的氨基酸序列一致性高达99%。首先通过RT-PCR和GFP转录融合方法证明colB1基因在BMB171中能够转录和表达,之后利用同源重组敲除BMB171中colB1基因。用突变体芽胞和Cry1Ac定量混合喂食棉铃虫幼虫,生测结果显示突变体芽胞与晶体蛋白混合感染时对棉铃虫的毒性比对照菌株低,但差异并不明显。将cry1Ac基因分别转入突变体BMB1242和对照菌株BMB171,直接用发酵液进行生物测定,结果显示突变体BMB1242-1Ac引起棉铃虫的死亡率明显比对照菌株低。因此,缺失colB1基因能够降低Bt对棉铃虫的毒力。本研究第二部分克隆来自cry1Ac基因的BtⅠ-BtⅡ启动子、SD序列以及终止子,并引入pET28a的His-tag和多克隆位点,在穿梭载体pHT304的基础上构建了一个苏云金芽胞杆菌表达载体pBMB1A。将cry1Ac以及具有非典型BtⅠ-BtⅡ启动子的cry2Ab、cry5Ba、cry6Aa、cry7Ba、cry55Aa六个基因装载到该表达载体上,显微镜检结果表明cry1Ac、cry5Ba、cry7Ba、cry55Aa均能形成正常晶体,SDS-PAGE结果也证实这四个重组质粒均能表达目的条带。同时,本实验选取Cry1Ac来考察His-tag标签对Cry1Ac杀虫活性的影响,生物测定结果显示重组菌株的LC50值与对照菌株相比无明显差异。因此,该载体可用于快速克隆表达不同类别的Cry蛋白。同时,我们利用ctc2基因启动子构建了另一个表达载体pBMBC2,并成功表达crylAc基因且能形成晶体。