论文部分内容阅读
马尔尼菲篮状菌病是由马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,T.marneffei)感染引起的致死性深部真菌病。T.marneffei主要感染HIV/AIDS患者,普通人群罕见感染。当艾滋病患者适应性免疫功能严重受损时,固有免疫系统(固有免疫细胞及其来源的炎性因子)如何抵御T.marneffei感染研究甚少,尤其是不同感染及治疗阶段机体免疫学变化仍未知。本研究从临床着手,对艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病患者治疗前后免疫指标进行动态监测,并通过一系列体内外实验探究并阐明当适应性免疫功能缺陷时,固有免疫细胞,尤其是巨噬细胞和中性粒细胞对T.marneffei的抗菌作用及分子机制。研究内容包括以下三部分:第一部分艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病患者治疗前后免疫状况动态研究[目 的]揭示艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病患者的临床特征、抗真菌治疗前后机体免疫指标动态变化及患者预后相关因素。[方 法]对艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病患者进行动态随访,检测不同治疗阶段免疫细胞和细胞因子/趋化因子谱,并收集抗真菌治疗不同阶段患者的临床症状、体征和实验室检测指标等资料。分析艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病患者临床特征、治疗前后免疫细胞/免疫炎性因子动态变化及患者预后相关因素。[结 果]1.41例病例组患者主要临床症状为发热、咳嗽/咳痰、腹痛/腹泻、皮损、体重下降、贫血。主要体征包括肝、脾及多发淋巴结(肺门、颈部、腹腔淋巴结)肿大、腹腔/胸腔积液等。入组患者CD4+T细胞数(14[9,28]cells/μ L)和CD8+T细胞数(169[103,33 1]cells/μL)显著低于单纯HIV感染者的CD4+T细胞数(351±46 cells/μL)和 CD8+T 细胞数(899,[703,1522 cells/μL]。随着有效的抗真菌治疗,患者CD4+T和CD8+T细胞数逐渐升高,而活化的CD4+T和CD8+T细胞占总CD4+T和CD8+T细胞数的比例逐渐下降。2.病例组患者的淋巴细胞绝对值及百分比显著低于健康对照组(p<0.001)和单纯HIV感染组(p<0.001);中性粒细胞绝对值及百分比高于健康对照组和单纯HIV感染组,且在抗真菌治疗后第3天和第7天达到峰值,随后逐渐降低至正常水平;单核细胞绝对值和百分比均低于健康对照组和单纯HIV感染组,且在治疗后第3天进一步下降,随后在治疗后第15天回升至正常水平。3.与健康对照组和单纯HIV感染组相比,病例组患者的促炎细胞因子(IL-12、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IL-18、IL-1β)、抗炎细胞因子(IL-10)及趋化因子(IP-10)水平在治疗前显著升高(p<0.05)。IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17A、IL-7、IP-10、IL-1β、SDF-1α和IP-10水平在抗真菌治疗后第3天进一步升高并达到峰值水平,治疗第7天后逐渐下降并恢复到正常水平。IL-18水平在治疗前、治疗后第3天和第7天显著升高,而治疗后第15天急剧下降至正常水平。同时,血浆IL-12和IFN-γ水平在治疗前达到峰值,并在治疗后开始逐渐降低,于第7天恢复到正常水平。4.死亡组患者TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β和IP-10水平高于治疗好转患者(p<0.05)及单纯HIV感染组(p<0.05)。[结 论]艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病患者适应性免疫功能严重受损,及时有效的抗真菌治疗联合ART可改善患者预后;患者适应性免疫功能严重缺陷时,固有免疫细胞(尤其是巨噬细胞和中性粒细胞)及其来源的细胞因子和趋化因子,在抵御T.marneffei感染过程中起主要作用;此外,由于T淋巴细胞严重缺失,免疫反应失衡,导致过度激活和渗出的炎性因子(“炎性因子风暴”)可能与艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病患者不良预后相关。第二部分马尔尼菲篮状菌上调NLRP3/Caspase-1/gasderminD通路诱导巨噬细胞焦亡机制研究[目 的]构建免疫功能低下小鼠T.marneffei侵袭性感染模型及巨噬细胞系感染模型,阐明巨噬细胞抵御 T.marneffei感染的分子机制并初步探索抗真菌联合免疫调节剂治疗对马尔尼菲篮状菌病预后的影响。[方 法]通过构建免疫功能低下BALB/c小鼠T.marneffei侵袭性感染模型,及体外T.marneffei感染巨噬细胞系模型,研究T.marneffei诱导巨噬细胞焦亡途径。通过免疫蛋白印迹、免疫组化、免疫荧光、ELISA等方法检测不同感染及治疗阶段小鼠脾脏以及体外与T.marneffei共培养的巨噬细胞焦亡相关蛋白、炎性小体、细胞因子等(Cleaved caspase-1、gasdermin D-NT、NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β、TNF-α)的表达。并在小鼠模型上行抗真菌同时联合免疫调节剂治疗,以期改善疾病预后。[结 果]1.T.marneffei可诱导由THP-1细胞分化的巨噬细胞内Cleaved caspase-1、NLRP3、ASC、TNF-α相对表达量增高(p<0.05),且培养上清细胞因子IL-18、IL-1β、TNF-α水平升高(p<0.05),随着培养时间延长巨噬细胞炎性小体及焦亡相关蛋白表达更显著;免疫调节剂沙利度胺在T.marneffei作为焦亡触发物时可进一步促进巨噬细胞焦亡,且促进胞内TNF-α合成但抑制胞外TNF-α分泌(p<0.05)。2.采用免疫功能低下BALB/c小鼠,腹腔注射酵母相T.marneffei构建全身性侵袭性感染模型成功。3.T.marneffei可诱导免疫功能低下BALB/c小鼠脾脏巨噬细胞焦亡,且随着病程进展细胞焦亡逐渐增强,表现为小鼠脾脏巨噬细胞焦亡相关蛋白及炎性小体(gasdermin D-NT、NLRP3、ASC、TNF-α)相对表达量逐渐升高,感染后死亡小鼠细胞焦亡相关蛋白及炎性小体相对表达量最高。4.单用沙利度胺治疗T.marneffei感染无效,联合两性霉素B治疗可减轻小鼠脏器炎性反应,小鼠体重有增加趋势,但不能提高小鼠的总体生存率。[结论]T.marneffei可能通过NLRP3/Caspase-1/gasdermin D通路诱导巨噬细胞焦亡,沙利度胺在T.marneffei作为焦亡触发物时可进一步促进巨噬细胞焦亡;沙利度胺可能通过促进巨噬细胞焦亡增强抗菌效应,联合两性霉素B治疗可改善小鼠脏器炎性反应,但并不能提高小鼠总体生存率。第三部分马尔尼菲篮状菌诱导中性粒细胞分泌囊泡抗菌的蛋白质组学和磷酸化组学分析[目 的]我们发现中性粒细胞可以趋向T.marneffei并形成分泌囊泡后耗竭死亡,故采用高通量组学技术在蛋白质及磷酸化修饰水平探索中性粒细胞抵御双相T.marneffei的抗菌机制以及发挥抗菌效应后的细胞本身死亡方式。[方 法]提取中性粒细胞系与T.marneffei共培养24 h及未与T.marneffei共培养的细胞总蛋白。采用高通量4D-Lable free蛋白质组学及磷酸化修饰组学技术,结合生物信息学系统分析T.marneffei感染中性粒细胞后差异表达蛋白质及差异磷酸化修饰位点对应蛋白质参与的抗菌相关机制。[结 果]1.体外细胞实验发现T.marneffei可诱导原始中性粒细胞分化为成熟的中性粒细胞,胞内颗粒增多并不断分泌囊泡。当中性粒细胞细胞分泌耗竭后与T.marneffei一同死亡。2.蛋白质组学分析,以2倍差异表达变化为阈值,共鉴定到165个差异表达蛋白,其中70个蛋白表达发生上调,95个蛋白表达发生下调。差异表达蛋白主要定位于细胞核、细胞质、细胞外基质和线粒体。T.marneffei感染组核糖体代谢及氧化磷酸化代谢活跃,NAD(P)H氧化酶系上调,并鉴定到一系列与分泌囊泡相关蛋白及抗菌相关蛋白。进一步功能分析及信号通路富集分析结果显示,差异表达蛋白主要富集在囊泡分泌、线粒体氧化磷酸化功能及细胞铁死亡通路上。3.进一步进行磷酸化修饰组学分析,以2倍差异表达变化为阈值,一共鉴定到248个差异磷酸化位点对应蛋白,其中111个差异磷酸化位点对应蛋白表达上调,137个差异磷酸化位点对应蛋白表达下调。差异磷酸化蛋白主要定位于细胞核、细胞质、质膜和细胞外基质。进一步功能分析及信号通路富集分析显示,差异磷酸化位点对应蛋白主要富集在囊泡分泌功能和细胞铁死亡通路上。[结 论]T.marneffei可诱导中性粒细胞颗粒物质合成增多并形成分泌囊泡,胞内囊泡和颗粒富含杀菌蛋白;与T.marneffei共培养的中性粒细胞核糖体代谢及线粒体氧化磷酸化代谢活跃;中性粒细胞可能通过NAD(P)H氧化酶依赖产生活性氧类物质抗T.marneffei;但过度释放活性氧类物质亦可导致中性粒细胞自身发生细胞铁死亡。