论文部分内容阅读
背景:肺癌是肺部最常见的原发性恶性肿瘤,因其发病率高、发现晚、预后差,成为死亡率增长最快,对人类生命健康构成最大威胁的恶性肿瘤之一。其中,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常见的肺癌类型,占肺癌的80%-85%。在过去的几年,免疫疗法的使用显著的提高了NSCLC患者的存活率,然而,NSCLC的总体治愈率和存活率仍然非常低,特别是对于那些在转移性疾病阶段的患者。因此靶向减弱NSCLC的转移,抑制其发展成为临床治疗的重要举措。Cathepsin K是属于木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶,主要存在于溶酶体中,是哺乳动物体内最有活性的蛋白水解酶。Cathepsin K与人类多种疾病相关,在骨质疏松中研究得较为透彻,此外密切关联肿瘤的发生与发展。有研究表明Cathepsin K与肺癌术后存活率具有显著相关性,但其在NSCLC中的具体作用研究尚少,因此通过探索Cathepsin K对NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制,以期为NSCLC的靶向医治提供参考。方法:1.培养人胚肺成纤维细胞MRC-5,人NSCLC细胞A549、H1299,提取总蛋白,通过蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测每组细胞中Cathepsin K及内参Tubulin/GAPDH的灰度值,分析计算每组细胞中Cathepsin K蛋白表达量。2.用免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测Cathepsin K在MRC-5及A549细胞中的定位及表达情况。3.用脂质体转染法对A549细胞进行转染,设置分组A549组、vector组、Cathepsin K-over expression(CTSK-OE)组、scramble组和Cathepsin K-knock down(CTSK-KD)组进行细胞生物行为学检测:CCK-8法检测细胞增殖能力;细胞划痕修复实验检测细胞迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。4.运用WB技术检测mTOR信号通路相关蛋白,探究Cathepsin K在NSCLC细胞中发挥作用的可能机制。结果:1.与人胚肺成纤维细胞MRC-5相比,人NSCLC细胞A549中Cathepsin K蛋白表达量升高,具有统计学差异(p<0.05);H1299中Cathepsin K蛋白表达量无明显升高。2.MRC-5细胞中,Cathepsin K在胞质中离散分布,A549细胞中Cathepsin K大量强烈表达并弥漫至整个胞质。3.与A549组和vector组相比,CTSK-OE组Cathepsin K mRNA水平极显著提高(p<0.001)。蛋白表达量增加,具有统计学差异(p<0.05)。增殖、迁移和侵袭能力增强,有统计学差异(p<0.05);与A549组和scramble组相比,CTSK-KD组Cathepsin K蛋白水平显著降低(p<0.01)。增殖、迁移和侵袭能力降低,有统计学差异(p<0.05)。4.与A549组和vector组相比,CTSK-OE组p-mTOR/mTOR比值增加,有统计学差异(p<0.05);与A549组和scramble组相比,CTSK-KD组p-mTOR/mTOR比值降低,有统计学差异(p<0.05)。结论:1.Cathepsin K在NSCLC细胞中高度表达,并且弥漫胞质。2.Cathepsin K的高表达促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭;Cathepsin K沉默后抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。3.Cathepsin K的高表达促进mTOR信号通路的激活;Cathepsin K沉默后抑制mTOR信号通路的激活。预测Cathepsin K通过介导mTOR信号通路参与NSCLC的进展。以上说明Cathepsin K有可能成为NSCLC治疗的新型靶点。