p21活化激酶1（p21-activated kinase1，PAK1）是一类胞内丝/苏氨酸蛋白激酶，在生物体内作用广泛，过去对PAK1的认识和研究集中于肿瘤领域，近年来，越来越多的研究发现其在发育过程中也有重要作用，但是目前对PAK1在胚胎血管发育中作用的研究仍然较少，尽管有研究显示PAK1与肿瘤血管新生和病理状态下的血管通透性增高有关，但是对其在正常生理性血管发育中的作用尚无明确报道。有研究发现PAK1是内皮特异性微小RNA miR-126的靶分子，而miR-126参与调控胚胎血管发育，因此推测PAK1对胚胎血管发育也有影响，但是其具体作用和潜在机制尚未明了。血管发育受到VEGF、PDGF、Notch、FGF等多条通路的调控，是一个精细而复杂的过程。Notch通路是其中最重要的通路之一，在成血管细胞的分化、内皮细胞的成熟、动静脉命运决定、血管出芽和新生等各个过程中都具有重要作用。有研究表明，在多种肿瘤细胞中，PAK1可以受到VEGF、PDFG等血管发育相关生长因子的刺激而被激活，且在人胚肾细胞中，PAK1可以通过磷酸化底物蛋白SHARP而抑制Notch通路，提示PAK1可能在血管发育中有一定的作用。研究目的：研究p21活化激酶1（p21-activated kinase1，PAK1）对斑马鱼胚胎血管发育的作用，明确PAK1对血管内皮细胞生物学特性的影响，探索PAK1在血管发育中调控机制，确认PAK1通过抑制Notch通路影响血管发育。研究方法：用常规PCR的方法克隆斑马鱼pak1的编码区序列，构建pak1重组真核表达质粒PCS2-pak1，用Not I单酶切的方法使质粒线性化后，用SP6RNA聚合酶在体外转录合成pak1的mRNA，用显微注射的方法将其注入野生型斑马鱼单细胞期胚胎，用注射相同剂量DEPC水的胚胎作为对照，观察不同浓度pak1和不同胚胎发育期的表型变化，记录表型异常的胚胎数，记录异常表型出现的时间和部位，观察这些胚胎的发育和转归；用内皮细胞特异表达红色荧光蛋白的Tg（flk1：mcherry-ras）转基因斑马鱼胚胎重复实验，用激光共聚焦显微镜观察血管形态、走形、数目和分支等情况，并与对照组胚胎进行比较；表型异常的胚胎和对照组胚胎用2%戊二醛和多聚甲醛固定，经包埋和切片后，用醋酸铀和铅进行染色，并在透射电镜下观察血管壁结构和血管内皮细胞形态。用脂质体转染的方法，将人组成激活型PAK1（constitutivelyactive PAK1，caPAK1）的重组过表达质粒pBSKI2-caPAK1转入体外培养的HUVEC，对照组为仅加入相同浓度脂质体溶液处理的细胞。转染后48h观察细胞形态改变，并用定量PCR验证PAK1过表达情况；确认PAK1可以成功过表达后，用MTT与HUVEC反应，用酶标仪检测溶液在490nm处的吸光度，以反映细胞活力；而后用抗增殖细胞核抗原PCNA抗体结合DAPI染色，检测过表达PAK1后内皮细胞增殖情况；用荧光标记的膜联蛋白V和7-氨基放线菌素D标记内皮细胞，用流式细胞仪分析内皮细胞凋亡情况；最后用定量PCR检测细胞间连接的mRNA水平，并进一步用细胞免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术观察血管内皮特异的黏着连接CDH5的表达和分布改变。在细胞水平通过转染重组质粒的siRNA的方法实现PAK1的过表达或敲低，检测下游通路的表达变化，筛选出现变化的通路，在胚胎水平通过显微注射mRNA或MO的方法增加或抑制PAK1的表达，进一步验证变化的通路，通过γ-分泌酶抑制剂DAPT浸泡胚胎的方式来抑制胚胎内的Notch通路，观察其所导致的表型变化，记录表型出现的概率、时间和空间分布，并和过表达pak1所产生的异常表型进行比较，而后构建含Notch胞内段NICD的重组质粒，通过向胚胎内注射NICDmRNA的方法在整体水平激活Notch通路，将其与pak1的mRNA进行共注射，观察表型的缓解或加重情况。结果：成功克隆pak1的编码区序列，并构建能够过表达pak1的真核表达载体PCS2-pak1；在野生型斑马鱼胚胎中显微注射pak1的mRNA后，实验组和对照组胚胎总体死亡和畸形率相当，实验组斑马鱼胚胎发育至受精后30-36h左右出现头部出血表型，可见过表达组斑马鱼出现头部出血表型，出血比例约20-30%，36-48hpf胚胎出血最为严重，出血比例最高，而胚胎发育至60hpf以后，出血逐渐缓解，出血胚胎数减少，72hpf以后，大部分胚胎出血停止，且出血胚胎均可继续存活，未见明显死亡增加或出现大体畸形，而对照组胚胎未发现相应表型。对Tg（flk1：mcherry-ras）转基因斑马鱼胚胎注射pak1mRNA后，在激光共聚焦显微镜下观察血管形态和分布，发现实验组胚胎头部出血部位血管存在异常分支，而两组胚胎躯干血管分布和走形均未见明显异常。用透射电镜进一步观察出血部位血管壁和内皮细胞结构，发现两组胚胎头部血管管腔均完整，其内都可见红细胞通过，但是与对照组相比，出血胚胎头部血管内皮细胞出现破坏。定量PCR检测发现pBSKI2-caPAK1转染HUVEC后，细胞内PAK1表达水平明显升高，转染后48h观察细胞形态，发现过表达PAK1后，HUVEC数目减少、体积缩小、形态变圆，并出现部分脱落；MTT检测发现过表达PAK1后内皮细胞活力明显降低（P <0.01），而PCNA/DAPI染色结果显示两组细胞增殖情况并无统计学差异（P>0.05），用Annexin V/7-AAD双染色结合流式细胞仪分析，可见过表达组HUVEC凋亡增加（P <0.01），定量PCR检测发现内皮细胞间黏着连接CDH5、CDH2均明显降低（分别为P <0.05和P <0.01），但紧密连接ZO-1和CLDN5表达改变无统计学差异（P>0.05）。进一步用细胞免疫荧光检测内皮特异的CDH5，可见胞膜上CDH5聚集减少。在细胞水平过表达PAK1后，Notch通路转录因子RBP-Jκ表达减少（P <0.05），HES1、HEY1、HEY2等下游靶分子出现下调（P<0.05），VEGF通路相关的FLK1表达无明显改变（P>0.05），PAK1敲低后，RBP-Jκ、HEY1、HEY2的表达都出现不同程度的升高（P <0.05），FLK1变化仍不明显（P>0.05）；在斑马鱼水平过表达和敲低PAK1后，Notch通路和VEGF通路相关分子的表达与细胞水平一致，PAK1过表达后，Notch调控的动静脉分化分子efnb2表达下降（P <0.05），Notch下游靶分子hey1、hey2、her6表达均减少（P <0.05），而抑制PAK1后，这些分子呈相反的表达变化。在斑马鱼胚胎水平用DAPT抑制Notch通路后，发现胚胎出现和PAK1过表达一致的出血表型，且两者出血比例相近，而用NICD激活Notch通路后无明显表型改变。在胚胎水平过表达pak1的同时激活Notch通路，可以挽救pak1引起的出血表型，出血胚胎数明显减少（20-30%vs.0-2%，P <0.01）。结论：在体实验证实PAK1通过影响内皮完整性调控胚胎血管发育，体外实验进一步表明PAK1主要通过影响内皮细胞凋亡及细胞间连接的表达影响血管发育，进一步探索其作用机制，发现PAK1通过抑制Notch通路影响胚胎血管发育。