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研究背景糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，发病率呈逐年递增的趋势，由此而导致的终末期肾脏病（end-stage renaldisease,ESRD）的发病率也越来越高。DN发病机制仍不十分明确，涉及体内多种蛋白、多条细胞信号通路的改变。DN的主要临床表现为蛋白尿、继发肾小球硬化、肾脏纤维化。足细胞作为一种高度分化的细胞，在维持肾小球滤过膜的完整性方面具有重要的生理意义。大量研究表明：足细胞受损是肾小球损伤的中心环节，多种理化、生物因素均可影响足细胞的功能，从而导致蛋白尿的发生。microRNA（miRNA）是近年发现的一种内源性、非编码小RNA，与其靶基因3’非翻译区（3’-UTR）的碱基互补配对，从而在转录后水平导致mRNA的降解或抑制，发挥负性调控作用。miRNA在生物的发育分化，细胞增殖、凋亡，及器官形成及疾病发生中发挥至关重要的作用。近年的研究表明miRNA可能参与了DN的发生发展，但其具体机制不详，需要进一步深入研究。近年来有少数研究表明miR-346可以通过调节GSK-3β并激活Wnt/β-Catenin通路调节人骨髓间充质干细胞的转分化，然而在高糖培养足细胞中miR-346的表达及其功能目前仍不明确。GSK-3β是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，是细胞转分化三条通路中一个重要的调控因子，在通路中起着承上启下的作用，我们前期的研究已经表明，GSK-3β参与了高糖环境下足细胞的转分化，miR-346能否通过调节GSK-3β从而影响高糖诱导的足细胞转分化，有待于进一步的研究。目的本研究通过检测不同糖浓度环境中小鼠足细胞miR-346表达，观察转染miR-346mimic和miR-346inhibitor对足细胞表型的影响，旨在探讨miR-346是否参与了高糖导致的足细胞转分化，并验证这种作用是否通过GSK-3β介导，从而初步探讨miR-346在DN早期发生、发展中所起的作用，为DN发生机制及治疗措施的研究提供一定的理论依据。方法1．不同浓度的葡萄糖中足细胞miR-346的表达变化，以不同浓度葡萄糖（12.5mmol/L,25mmol/L）培养足细胞36h，并含正常对照组(5.6mmol/L葡萄糖)和高渗对照组（5.6mmol/L葡萄糖+44.4mmol/L甘露醇），应用RT-PCR检测足细胞miR-346表达。2．利用miR-346mimic/inhibitor转染高糖（25mmol/L葡萄糖）培养足细胞，并设高糖对照组（25mmol/L葡萄糖）。应用Western-blot检测足细胞表面标记蛋白nephrin，间充质细胞表面标记蛋白α-SMA。3．构建GSK-3β mRNA3ˊ-UTR及miR-346荧光素酶报告质粒，共转染293T细胞，双荧光素酶活性检测验证GSK-3β mRNA的3ˊ-UTR与miR-346有无直接结合。4．利用miR-346mimic/inhibitor转染（5.6mmol/L葡萄糖）培养足细胞，应用Western-blot检测足细胞内GSK-3β在蛋白水平的变化。结果1．miR-346在高糖刺激的足细胞中的表达与正常糖（5.6mmol/L）对照组比较，12.5mmol/L高糖组中，足细胞中miR-346的表达显著升高（P<0.05）；随着糖浓度的增加，miR-346表达量降低，25mmol/L高糖组miR-346表达量与12.5mmol/L高糖比较，miR-346的表达显著降低（P<0.05），但与正常对照组比较表达量无明显改变（P>0.05）。2．miR-346mimic/inhibitor转染足细胞后nephrin, α-SMA与高糖（25mmol/L）组比较，转染miR-346mimic后，足细胞表面标记蛋白nephrin表达明显升高，间充质细胞标记蛋白α-SMA表达降低（P<0.05）；而转染miR-346inhibitor后，与高糖组比，足细胞表面标记蛋白nephrin表达降低，间充质细胞标记蛋白α-SMA表达升高(P<0.05)。3．双荧光素酶报告验证miR-346对GSK-3β有无调控作用成功构建GSK-3β mRNA的3ˊ-UTR及miR-346的荧光素酶报告质粒，并以转染miR-346及野生型GSK-3β质粒的293T细胞为实验组，内参为海肾荧光素酶活性，相对荧光素酶活性为萤火虫荧光活性和海肾荧光活性的比值，转染miR-346质粒的细胞与重组载体的细胞荧光素酶活性与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。4. miR-346mimic/inhibitor转染正常糖足细胞后GSK-3β的变化与正常糖（5.6mmol/L）组比较，转染miR-346mimic后，GSK-3β的蛋白表达降低（P<0.05）；转染miR-346inhibitor后，与正常糖组比较，GSK-3β的蛋白表达无明显变化。结论1．体外培养的小鼠足细胞中高糖影响miR-346表达，初步证明了miR-346可能参与了DN的早期发生、发展过程。2．过表达miR-346能够抑制高糖诱导的足细胞转分化。3．miR-346可能通过GSK-3β参与了高糖导致的足细胞转分化。