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多酚氧化酶(PPO)是导致面条、馒头、饺子等面制食品发生褐变的主要因素,降低小麦籽粒中的PPO活性可以有效改善面制食品的外观品质。由于目前主要采用生化的方法测定小麦籽粒中的PPO活性,存在成本高、易受环境影响、不能在育种早代材料中检测、选择效率低等问题,因此研究小麦PPO基因遗传变异的规律,开发出小麦籽粒PPO活性功能标记,对于低籽粒PPO活性分子育种和我国面制食品外观品质的改良有重要意义。本研究对NCBI上最新公布的小麦PPO基因序列进行了搜索和比对并根据在小麦籽粒中表达的PPO基因序列设计引物,对这些引物的功能进行验证,开发小麦籽粒PPO活性功能标记。同时研究中国小麦种质资源的籽粒PPO活性遗传变异和基因型的分布规律以及PPO基因的等位变异对籽粒PPO活性的影响,获得了如下主要结果:1.根据NCBI网站上新注册的3条小麦PPO基因(GenBank:AY515506、AY596270和AF507945)序列,在不同位置设计了多对引物,对7个高PPO活性和7个低PPO活性小麦品种进行PCR扩增,结果发现其中一对引物(STS01)在高、低PPO活性材料中表现出多态性。该引物在7个低PPO活性的材料中能扩增出560 bp的目标片段,在7个高PPO活性的材料中没有扩增出目标片段,利用中国春缺体、四体及双端体将该标记定位在2D染色体长臂上。利用该标记检测130份小麦品种,结果表明有75个品种可以扩增出560 bp的目标片段,其PPO活性均值为221.08;55个品种没有扩增出目标片段,PPO活性均值为309.98,方差分析表明两者的差异达极显著水平(P＜0.01)。利用STS01和PP018(小麦2A染色体上PPO基因STS分子标记)共同检测后发现,在130份小麦品种中有37个品种的双标记扩增均表现出高活性带型(H1H2),这些品种PPO活性的均值为337.82,显著高于其他几种扩增带型品种的PPO活性均值(P＜0.01)。32个双标记扩增均表现为低活性带型(L1L2)的小麦品种PPO活性值普遍较低,可作为改良面制食品外观品质的候选亲本。因此STS01是一个位于小麦2D染色体长臂上PPO基因分子标记,可以在小麦PPO活性分子标记辅助选择中加以应用。2.通过对NCBI上注册的小麦PPO基因序列的搜索与比对后发现,现有的小麦PPO基因按表达方式可分为两大类(Ⅰ、Ⅱ),其中第Ⅱ大类的PPO基因与小麦籽粒PPO活性密切相关,第Ⅱ大类第ⅰ小类中的PPO基因可能位于小麦2A、2D以外的染色体上,可做为改良面团色泽的侯选基因。通过对具有完整开放阅读框(ORF)的4条PPO基因比对后发现,位于小麦2D染色体长臂上的PPO基因(PPO-2D)存在丰富的等位变异,等位基因间有94个单核苷酸变异(SNP),其中发生在编码区的有80个(cSNP),这些cSNP中有36个影响到基因编码的氨基酸序列,属非同义cSNP。在非同义cSNP处,设计引物(STS-H),对130个已连续测得两年PPO活性的小麦品种进行PCR扩增,结果发现STS-H在大部分低PPO活性品种中没有扩增出目标片段(a),而大部分高PPO活性品种可以扩增出460bp的目标片段(b)。方差分析表明,a、b两种类型品种的PPO活性均值差异达极显著水平(p＜0.01),说明非同义cSNP对小麦籽粒PPO活性有重要影响。与STS01比较后发现,STS-H与STS01是一对互补标记,根据STS01和STS-H引物各自的特点,研究了能同时扩增两对引物的多重PCR反应体系。3.以251份基因多样性丰富的中国小麦微核心种质资源为试验材料,2004-2005年度种植于两个地点(安徽合肥、凤阳),采用生化和特异引物PCR扩增的方法对其PPO活性及基因型进行了鉴定。结果表明:中国小麦微核心种质资源品种间PPO活性差异明显,并且低PPO活性的品种居多;基因型、地点及其互作对PPO活性的影响达到1%显著水平。利用控制小麦PPO活性两个主效基因位点的特异PCR引物扩增结果表明,中国小麦微核心种植资源中共检测出PPO-2Aa1/PPO-2Da2(a1a2)、PPO-2Aa1/PPO-2Db2(a1b2)、PPO-2Ab1/PPO-2Da2(b1a2)和PPO-2Ab1/PPO-2Db2(b1b2)四种标记基因型,标记基因型间PPO活性均值的大小顺序为:a1a2＜a1b2＜b1a2＜b1b2,方差分析表明均值间差异达1%显著水平,与环境互作分析表明标记基因型与地点的互作效应不显著(P＜0.05)。小麦不同位点上的PPO等位基因出现频率有较大差异,2A染色体上PPO等位基因(2Aa1＼2Ab1)出现频率相近,而2D染色体上PPO等位基因2Da2的出现频率约是2Db2的4倍,单倍型效应分析表明相同染色体上单倍型间的PPO活性关系为:PPO-2Aa1＜PPO-2Ab1,PPO-2Da2＜PPO-2Db2。按照麦区,冬、春性以及地方和育成品种对试验材料进行归类和分析,结果表明华南冬麦区的小麦品种PPO活性均值最低,显著低于(P＜0.01)西南冬麦区、三个春麦区(西北、东北和北部春麦区)和从国外引进的品种,其它麦区间的PPO活性差异不显著(P＜0.01);来源于5个冬麦区的小麦品种的PPO活性均值显著(P＜0.01)低于来源于3个春麦区小麦品种的PPO活性均值:地方小麦品种的PPO活性均值最低,显著(P＜0.01)低于育成品种和国外引进品种的PPO活性均值,说明小麦PPO活性在地区分布上存在一定的规律性,小麦品种的PPO活性与品种来源和人工选择有关。4.为了克隆出小麦不同染色体上控制籽粒PPO活性的PPO基因,利用小麦2A和2D染色体上PPO基因一致性高的特点,在两个基因(PPO-2A和PPO-2D)相同序列处设计了一对引物(PPO05),对高、低活性不同的小麦品种进行扩增,结果发现1.5%琼脂糖凝胶上PP005在低PPO活性小麦品种中可以扩增出两条带(a:位于DNA Marker1000-750bp之间和b:750-500bp之间),而在高PPO活性小麦品种中只扩增出一条位于750-500bp之间的条带(b)。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果发现b条带实际包含2-3条长度相近的DNA片段。对这些条带进行分离、纯化和测序,并在NCBI网站上进行BLAST研究,结果发现PP005同时扩增出了小麦2A和2D染色体上的PPO基因,并且发现其中一条PPO基因序列(4号带)可能是小麦PPO基因新的变异类型。