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研究背景:肌肉生长抑制素(MSTN)为转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一,是骨骼肌高表达的负调控其生长发育的分泌型蛋白。此外MSTN还具有调节糖代谢、脂代谢等作用。既往研究表明,2型糖尿病(T2DM)及胰岛素抵抗人群血清和骨骼肌MSTN水平升高。T2DM小鼠骨骼肌MSTN表达增加,接受MSTN抗体注射后,空腹和餐后血糖水平改善。推测MSTN可影响机体对葡萄糖的摄取和利用,参与胰岛素抵抗的发生。但迄今为止MSTN参与调节T2DM胰岛素抵抗的分子机制尚不明确。本研究以CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的MSTN基因敲除(KO)小鼠为基础,采用高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(STZ)构建T2DM动物模型,观察体成分、肌力、抗疲劳能力、血糖调节能力、骨骼肌组织病理学变化情况,并测定胰岛素信号通路相关蛋白的表达水平,探究MSTN对T2DM状态下骨骼肌糖代谢及胰岛素抵抗的影响。目的:探究MSTN对T2DM小鼠胰岛素抵抗及骨骼肌胰岛素信号通路的影响。方法:由CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MSTN基因敲除杂合C57BL/6N小鼠,通过繁育及PCR鉴定,最终得到野生型(WT)、杂合型[MSTN(+/-)]、纯合型[MSTN(-/-)]雄性小鼠各12只,再随机各分为2组,共6组,每组6只,分别为:WT组、MSTN(+/-)组、MSTN(-/-)组、WT+DM组、MSTN(+/-)+DM组、MSTN(-/-)+DM组,前三组给予普通饮食6周,后三组给予高脂饮食6周+小剂量STZ诱导T2DM模型。测定空腹血糖(FPG)评价造模成功后,各组小鼠均测定体重(BW)、体长(BL)、腹围(AC)、腓肠肌重量(GMW)、内脏脂肪重量(VAW)并计算体重标准化比值(GMW/BW、VAW/BW)评价体成分变化,测定抓力、转棒力竭时间评价肌力、抗疲劳能力,ELISA测定空腹血清胰岛素(FIns)并计算胰岛素敏感指数(ISI)和稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),结合葡萄糖耐量试验(GTT)、胰岛素耐量试验(ITT)及曲线下面积(AUC)直接或间接评价机体血糖调节能力、胰岛素敏感性和胰岛素抵抗程度。HE染色分析腓肠肌肌纤维形态及横截面积。蛋白免疫印迹法(WB)测定腓肠肌MSTN及胰岛素信号通路关键分子Ins R、IRS1、p-IRS1、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GLUT4、GSK3β、p-GSK3β蛋白表达水平。采用SPSS软件对多组计量资料进行单因素方差分析(ANOVA),采用Image J软件对WB、HE染色图像进行半定量分析,采用Graph Pad Prism软件作图。结果:1、WT+DM组小鼠较WT组BW、AC、GMW/BW、抓力、转棒力竭时间、腓肠肌细胞横截面积明显减小,VAW/BW、腓肠肌MSTN明显升高(P<0.05),BL无统计学差异(P>0.05)。WT+DM较WT组FPG、HOMA-IR、GTT-AUC、ITT-AUC升高,FIns、ISI降低,腓肠肌Ins R、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、GLUT4、pGSK3β/GSK3β明显降低(P<0.05)。2、WT组、MSTN(+/-)组、MSTN(-/-)组小鼠VAW/BW、转棒力竭时间无统计学差异(P>0.05)。MSTN(-/-)组较WT组BW、BL、AC、GMW/BW、抓力、腓肠肌细胞横截面积明显增加,腓肠肌MSTN明显减少(P<0.05),MSTN(-/-)组较MSTN(+/-)组BL、AC、GMW/BW、腓肠肌细胞横截面积明显增加,腓肠肌MSTN明显减少(P<0.05),MSTN(+/-)组较WT组腓肠肌细胞横截面积明显增加,腓肠肌MSTN明显减少(P<0.05)。3、WT组、MSTN(+/-)组、MSTN(-/-)组小鼠FPG、FIns、ISI、HOMA-IR无统计学差异(P>0.05)。MSTN(-/-)组较WT组GTT-AUC明显降低(P<0.05),ITT-AUC、腓肠肌p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、GLUT4、p-GSK3β/GSK3β明显升高(P<0.05)。4、WT+DM组、MSTN(+/-)+DM组、MSTN(-/-)+DM组小鼠转棒力竭时间无统计学差异(P>0.05)。MSTN(-/-)+DM组较WT+DM组BW、BL、AC、GMW/BW、抓力、腓肠肌细胞横截面积明显增加,VAW/BW、腓肠肌MSTN明显降低(P<0.05),MSTN(-/-)+DM组较MSTN(+/-)+DM组AC、GMW/BW、腓肠肌细胞横截面积明显增加,腓肠肌MSTN明显降低(P<0.05),MSTN(+/-)+DM组较WT+DM组AC、GMW/BW、腓肠肌细胞横截面积明显增加,VAW/BW、腓肠肌MSTN明显降低(P<0.05)。5、WT+DM组、MSTN(+/-)+DM组、MSTN(-/-)+DM组小鼠FPG、FIns无统计学差异(P>0.05)。MSTN(-/-)+DM组较WT+DM组ISI绝对值、HOMA-IR、GTTAUC、ITT-AUC明显减小,腓肠肌Ins R、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、GLUT4、p-GSK3β/GSK3β明显升高(P<0.05)。结论:1、T2DM引起肌量减少,内脏脂肪堆积,肌力、抗疲劳能力减弱,可能与MSTN增加引起的肌细胞萎缩有关;下调胰岛素信号通路,抑制葡萄糖转运及糖原合成,引起胰岛素抵抗。2、MSTN表达缺失引起体重、体型增大,肌量、肌力增加以及肌细胞肥大;上调胰岛素信号通路,促进葡萄糖转运及糖原合成,增强血糖调节能力及胰岛素敏感性。3、MSTN表达缺失能在一定程度上拮抗T2DM引起的肌量减少、内脏脂肪堆积、肌力减弱、肌细胞萎缩;能在一定程度上拮抗T2DM对胰岛素信号通路的负性影响,增加葡萄糖转运及糖原合成,改善糖耐量减低及胰岛素抵抗。