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苎麻(Boehmeria nivea)是一种我国传统的重要纤维作物,其麻皮纤维是主要收获物。当今一些模式植物纤维素合成分子生物学研究取得了良好的进展,为苎麻纤维素合成的分子生物学研究提供了丰富的参考。 本研究以苎麻为材料,提取其总RNA并反转录成cDNA,通过设计一对简并引物扩增出纤维素合成酶基因中间片段,然后通过RACE技术分别获得基因3′端包含多聚A尾的序列和5′端大部分序列(尚缺失包括起始密码子在内的约450bp序列)。将三段序列分别测序并拼接成一长3276bp的cDNA序列,其读码框可翻译成一段包含938个氨基酸的蛋白质。经BLAST及蛋白质结构分析,证实我们得到的cDNA序列即是苎麻纤维素合成酶基因序列,按照纤维素合成酶基因命名规则将其命名为BnCesA1,并将此序列提交GenBank,登陆号为:DQ077190。 为了进一步了解BnCesA1基因在苎麻组织中的表达情况,揭示苎麻纤维素合成及其基因表达调控机制,以BnCesA1基因3′端非保守区域为检测目的基因,苎麻18S rRNA为内参基因,应用RT-PCR技术对苎麻纤维素合成酶基因的表达进行半定量,建立一个针对BnCesA1的特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系。结果显示在苎麻根、茎、叶、芽中都可检测到BnCesA1基因的表达,其表达模式为:茎>叶>芽>根,相对表达量依次为:0.791,0.381,0.319,0.183;推导BnCesA1蛋白与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtCesA1蛋白具有很高的一致性和同源性(87/93%);功能上可能参与苎麻细胞初生和次生壁的形成。 通过PCR将BnCesA1基因中编码纤维素合成酶催化和底物结合结构域的cDNA序列从T载体上释放,反向插入到植物表达载体pWM101中,将其置于35S启动子下游,并通过PCR和酶切实验验证,获得了在植物中组成型表达反义BnCesA1核心区段的表达载体。以农杆菌介导将其转化模式植物—