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本实验室将克隆到的猪生长激素(pGH)基因亚克隆到真核表达载体VRl020上得到pGH基因以正确方向插入的重组真核表达质粒,命名为VpGH。将此重真核表达质粒转化大肠杆菌TOPl0F,用质粒PCR和酶切的方法验证此重组质粒为正确插入pGH。大量制备VpGH。以薄膜法制备脂质体,用这种脂质体包裹VpGH。我们初步研究了脂质体包裹VpGH这种新型基因制剂的性质;探索了脂质体包装VpGH转染动物的增重效果和pGH基因在动物体内的表达。用此脂质体包裹VpGH,单独注射21日龄昆明小鼠后,分别在注射后的O,1,2,3,4,5周称其体重,同时每周用断尾采血分离血清,用ELISA分析免疫小鼠GH,IgG水平,检测淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和白细胞数量的变化,观察此VpGH脂质体包装后对小鼠的增重效应和免疫保护的调节作用。实验结果发现:脂质体包装VpGH注射小鼠的组较对照组体重增加均显著提高(P<0.05),较空白组体重增加也有显著提高(P<0.05),最高在第四周比对照增重率高20个百分点。实验的六周内注射VpGH组平均每天增重0.65g,而对照组平均每天增重O.54g。细胞免疫指标较对照组和空白组均明显提高,使用大肠杆菌弱毒株攻毒结果发现相同剂量下注射VpGH部分小鼠健康存活,而对照组小鼠发病,出现以胃、十二指肠、空肠粘膜等处出血、肝脾肿大等为主的病变。这些结果表明:此脂质体包裹VpGH可促进小鼠生长同时增强小鼠体液和细胞免疫应答水平,增强对微生物感染的抵抗力。
每周将注射VpGH的小鼠杀死一只,取其心,肝,脾,肾,肌肉用于表达研究。从心,肝,脾,肾,肌肉中提取总的DNA,用PCR的方法检测,发现在各个组织中均无pGH基因整合到宿主基因组上的现象,说明转染动物的质粒是在动物细胞中瞬时表达的。从心,肝,脾,肾,肌肉组织提取总蛋白,经westen_blot分析,结果发现在肌肉组织中GILt表达明显增加。根据小鼠实验所得到的结果我们将这种基因制剂在猪身上做了实验。将脂质体包裹VpGH注射实验猪,在0,2,4,6周检测了对猪的增重和GH的表达量。
结果发现:与对照组对比,白猪的增重增加明显,在第二周,第六周注射VpGH组增重和对照相比达到显著水平,增重率在第六周比对照高达50个百分点。白猪注射脂质体包裹VpGH的组平均增重达到0.5Kg/天,对照仅有0.3Kg/天。花猪组增重不明显,平均增重都在0.3Kg/天左右。对照小鼠实验,所有这些结果都提示脂质体包裹VpGH基因制剂既能促进动物的生长,又可以部分增强动物的免疫机能和免疫应答反应;增强对传染病的抗病力,有望成为一种新型高效的猪用DNA分子促长基因制剂。