内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(ENGase)是一类水解N-糖蛋白中核心壳二糖之间β-1,4-糖苷键的酶类。它具有两大家族,即糖苷水解酶85家族(GH85)和糖苷水解酶18家族(GH18)。GH18,如Endo-H,具有水解糖苷键的功能。而Endo-A和Endo-M等GH85除具有水解酶功能外,还具有将整个寡糖转移到N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)受体的转糖基功能。化学酶合成法合成均一糖蛋白就是利用该类酶的转糖基功能。甲醇诱导型酵母Ogataea minuta(O.minuta)来源的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(Endo-Om)是GH85成员之一。Endo-Om是一种酵母细胞的非糖基化胞质蛋白,在表达功能性的非糖基化蛋白质时,大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)有很多酵母不具备的优点,如生长迅速,表达量高,有多样的表达载体及各种被修饰的宿主菌等。本研究选用E.coli表达重组的Endo-Om,发现Endo-Om在宿主菌E.coli BL21(DE3)p LySs中能够大量地表达,但多数存在包涵体中。通过培养条件的优化,成功得到有活性的可溶性蛋白,实现Endo-Om在E.coli的纯化。纯化的蛋白具有水解荧光标记寡糖的活性。尽管GH85转糖基功能被广泛的研究和应用,但目前为止,对该类酶的底物识别机理了解甚少。本研究除了成功实现Endo-Om在E.coli的纯化外,还研究Endo-Om的295位色氨酸(Trp-295,W)对酶底物特异性的影响。Endo-Om与寡糖底物Man3GlcNAc2Asn的预测三维结构显示,Trp-295并非直接参与酶的催化反应,而是与底物的α-1,3-甘露糖形成一种重要的相互作用。需要指出的是,Trp-295只在真核生物ENGase中高度保守。通过定点突变对该位点进行研究,当Trp突变为丙氨酸(Ala,A)、谷氨酸(Glu,E)、谷氨酰胺(Gln,Q)时,该酶丧失活性。但是突变为苯丙氨酸(Phe,F),W295F突变体与野生型相比,对氨基吡啶(PA)荧光标记寡糖的水解能力具有2到3倍的增加,同时,该突变体对糖蛋白的水解活性也明显提高。而Trp突变为酪氨酸(Tyr,Y)时,W295Y突变体在对高甘露糖型寡糖水解能力变弱的同时却明显提升对缺少半乳糖的双天线型寡糖(GlcNAc2Man3GlcNAc2-PA)的水解活性。因此,通过突变实验得知,Endo-Om的295位点需要有芳香族的氨基酸维持其水解活性,并且该位点参与底物识别。总之,本实验探究Endo-Om的底物识别机理,发现W295F突变体与底物的亲和力增强,明显提高水解活性,这将加速其他ENGase蛋白质工程的研究。