水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物。由玉米狄克氏菌（Dickeya zeae）引起的水稻基腐病是重要的水稻细菌性病害。为了更好地防控该病害,需要从分子层面深入了解水稻基腐病菌的致病机理,为发展水稻基腐病新的防控策略和防控手段提供坚实的理论支撑。细菌第二信使c-di-GMP在细菌中广泛存在,调控多种细胞表型,包括:运动性、生物被膜、毒性因子和细胞分裂等等。在细胞内,包含有GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶（DGC）控制c-di-GMP合成,而含有EAL或者HD-GYP结构域的磷酸二酯酶（PDE）催化c-di-GMP降解。而且,细菌通过感应多种环境信号调控c-di-GMP分子浓度,通过下游的多种效应途径控制不同的表型。在细菌中,已发现c-di-GMP信号系统调控的三种分子机制,分别是具有特异性代谢途径的多靶点表型输出机制,单靶点单效应子表型输出机制和单靶点多效应子表型输出机制。此外,c-di-GMP信号系统具有两种调控模式,分别是空间局部调控模式和总体调控模式。在先前的研究中,通过生物信息学发现玉米狄克氏菌（D.zeae,EC1）中编码19个与c-di-GMP代谢相关的蛋白,单基因敲除体的表型试验发现,c-di-GMP信号分子主要影响EC1在浮游状态和附着状态之间的转变,即细胞运动性和生物被膜的形成,对于毒素zeamines和胞外降解酶的产量无显著影响。尽管如此,简单的单基因敲除方法并不能系统解析c-di-GMP信号网络在EC1中调控的分子机制和模式;在EC1中cdi-GMP是以一个总体信号调控模式来控制下游表型?还是以局部调控的模式为主?对此的研究仍无人知晓;第二信使c-di-GMP触发下游表型改变的具体浓度在大多数细菌中也未被研究。因此,本研究旨在更深一步揭示c-di-GMP信号系统在EC1中的调控途径和模式,为进一步解析EC1致病的分子机制提供科学依据。在本研究中,针对以上问题进行了深入试验。首先,采用叠加敲除的方法,在EC1中分别相继敲除c-di-GMP合成酶基因/结构域共15个和降解酶基因/结构域共7个,得到c-di-GMP合成功能完全缺失的突变体15ΔDGC和降解功能完全缺失的突变体7ΔPDE。试验结果表明,在EC1中c-di-GMP信号分子对细菌浮游和附着状态的表型转变起着至关重要的作用,并且影响细菌在寄主水稻种子表面的定殖和入侵能力;接着,通过检测所有叠加敲除中间体菌株的游动性表型和胞内c-di-GMP浓度,我们发现EC1的游动性遵循不同c-di-GMP剂量浓度的反应模式,并且确定调控EC1胞内c-di-GMP总体信号浓度的3个关键蛋白,包含一个DGC蛋白DGC13,两个降解酶蛋白PDE14和PDE6;然后,我们通过体外酶活性试验鉴定了PDE14具有催化降解cdi-GMP的活性。另外,本文还探讨了EC1中c-di-GMP信号系统与其他信号系统包括群体感应系统和腐胺信号系统的关系。试验结果表明,在c-di-GMP全敲除体15ΔDGC和7ΔPDE中外源加入群体感应信号OHHL和腐胺（putrescine）均不能改变突变体的游动性;通过q PCR和细菌胞内c-di-GMP测定发现,在群体感应和腐胺信号关键基因敲除体Δexp I和Δspe A中,c-di-GMP分子合成和代谢基因的表达量并未显著改变,而且,c-di-GMP信号浓度在Δexp I和Δspe A中也没有显著性增加或者降低。试验结果表明,在EC1中c-di-GMP很可能与群体感应系统和腐胺信号系统平行调控细菌游动性。最后,我们通过结构域同源比对,鉴定到两个包含c-di-GMP分子特异性结构域（Pil Z结构域）的受体Ycg R和Bcs A,其同源蛋白分别在沙门氏菌中作为鞭毛运动刹车和生物被膜基质组分,均涉及细菌游动性的调控。表型试验中,在7ΔPDE中叠加敲除ycg R和bcs A后,突变体的游动性表型完全恢复到野生型EC1水平;除此之外,Δbcs A显著影响细菌的Rdar（red,dry and rough）形态和生物被膜形成。通过氨基酸同源比对、氨基酸点突变、体外蛋白纯化和ITC试验,我们证明了Ycg R蛋白与c-diGMP分子具有较强的结合能力;由于Bcs A蛋白结构具有信号肽和跨膜结构域等复杂结构,目前我们仍旧未能证明Bcs A与c-di-GMP分子具有结合能力。总之,本研究通过叠加敲除基因的方法,系统解析了细菌第二信使c-di-GMP分子在EC1中的调控网络,并对相关蛋白进行了功能鉴定,提出在EC1中c-di-GMP信号系统采用单靶点多效应子表型输出机制调控游动性,并推断出在EC1中c-di-GMP分子的调控模式为总体调控模式。也就是说,在EC1中由几个主要的代谢蛋白控制细菌内c-di-GMP信号的总体浓度变化,c-di-GMP总体信号通过多个受体调控细菌游动性表型。并且,本研究初步探究了c-di-GMP信号系统与其他信号系统的关系,以上研究为进一步了解c-di-GMP调控系统与EC1致病性的关系提供了科学的试验依据。