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米曲霉是一种常见的发酵用微生物,广泛应用于制作豆豉及酿造酱油中。酱油酿造根据发酵工艺的不同,可分为无盐固态发酵、低盐固态发酵和高盐稀态发酵,现在较为常用的为后两种。盐分的存在不仅可以抑制杂菌的生长,还与酱油特殊风味的形成密切相关,但是发酵时的盐分处理同时也会对米曲霉菌株的生长产生抑制作用,因此有必要对米曲霉进行进一步的优化。目前为止,关于米曲霉在盐胁迫下的应答机制鲜有报道,有必要对其进行更深入的研究,为改造和选育更适合应用的米曲霉菌株提供一定的实践依据。基于上,本课题进行了以下方面的研究:1.盐胁迫下米曲霉的生长及代谢物质分析:接种新鲜米曲霉孢子于含0%,5%,10%,15%氯化钠的PDA培养基中,30℃,培养72 h,以盐浓度0%为对照,观察米曲霉的生长情况,测定米曲霉的干生物量和孢子数量。结果显示,对照组干生物量一直处于同时间点最高值,盐胁迫导致了米曲霉生物量的下降,特别是48 h后,干生物量的变化更加明显,盐浓度越高,抑制作用越明显。15%盐浓度培养下,36 h之前,基本不生长。但米曲霉在各盐浓度实验组平板上的生长趋势基本一致,在培养60 h后生物量基本不变化,达到稳定期。盐胁迫下米曲霉分生孢子的产生受到抑制,高盐度组较为明显。对培养72 h的米曲霉菌丝体进行收集,测定胞内脂肪酸种类与含量,并进行转录组测序。结果显示,18碳脂肪酸与16碳脂肪酸的含量占米曲霉总脂肪酸含量的95%以上,米曲霉中的主要脂肪酸是棕榈酸(Palmitic acid,C16:0),硬脂酸(Stearic acid,C18:0),油酸(Oleic acid,C18:1)和亚油酸(Linoleic acid,C18:2)。与0%对照组相比,盐胁迫组中C18含量略高,C16含量略低,不饱和脂肪酸的含量显著高于饱和脂肪酸含量。转录组数据显示,与0%对照组相比,在三个盐度处理组中总共4578个基因显示出差异表达水平,其中有848个基因为3个盐浓度组所共有,15%盐浓度下的差异基因数量要明显多于5%与10%盐浓度组,表明在15%盐度组发生了更为复杂的生物代谢反应,结合代谢通路发现,差异表达基因参与了米曲霉中精氨酸生物合成以及亚油酸生物合成,其中硬脂酸去饱和酶基因表达水平在5%盐浓度时明显上调。2.盐胁迫相关基因在酵母中的功能鉴定:使用qRT-PCR对米曲霉硬脂酸去饱和生成油酸的限速酶基因AoD9D1和AoD9D2进行表达模式分析发现,AoD9D1的表达从适应期变为对数期和稳定期后逐渐增加,而AoD9D2在适应期具有最高表达水平,在对数期和稳定期表达较少,AoD9D1和AoD9D2在盐浓度升高情况下表现出逐渐增加的表达。基因结构分析发现,AoD9D1和AoD9D2均含有FAD和Cyt-b5结构域,进化分析发现,米曲霉AoD9D1和AoD9D2明显属于两组,并且两组都与米曲霉RIB40中的D9D具有较近的亲缘关系,蛋白性质分析发现,AoD9D1基因编码456个氨基酸,分子量约为51.9 kDa,理论等电点为9.10,亲水性平均系数为负值,具有3个跨膜区域,AoD9D2基因编码469个氨基酸,分子量约为53.6 kDa,理论等电点为9.01,亲水性平均系数为负值,其同样具有3个跨膜区域。将AoD9D1和AoD9D2及其结构域共6个基因分别进行载体构建,使用PEG/LiAc法转化野生型和D9D敲除酿酒酵母,进行液体发酵及脂肪酸含量测定。结果显示,异源表达AoD9D1和AoD9D2基因提高了野生型酿酒酵母的耐盐性,其中异源表达AoD9D1基因的菌株耐盐性要略强于异源表达AoD9D2基因的菌株耐盐性。与野生型相比,D9D敲除的酵母菌株表现出较低的耐盐性,当AoD9D1和AoD9D2转化到D9D敲除菌株中时,盐耐受性在7%及更高浓度下明显增强,且AoD9D1转化菌株比AoD9D2转化菌株具有更高的耐盐性。在5%低盐浓度时,结构域转化酵母的生长均受到了不同程度的抑制,而随着盐浓度的升高,AoD9D1基因的两个结构域转化菌株表现更强的盐胁迫耐受性,而AoD9D2基因的两个结构域转化菌株则无此效果。以上酵母菌株脂肪酸数据分析发现,异源表达AoD9D酿酒酵母中不饱和脂肪酸,包括棕榈油酸和油酸的含量明显增高,而饱和脂肪酸,主要包括棕榈酸和硬脂酸的含量则减少,异源表达AoD9D1菌株中脂肪酸含量的变化比异源表达AoD9D2菌株更明显。相较于AoD9D2结构域转化株,AoD9D1结构域的野生型和D9D敲除酿酒酵母转化株呈现出较高水平的不饱和脂肪酸含量。3.AoD9D1基因在米曲霉中的过表达及表型分析:鉴于AoD9D1基因提高酵母耐盐性的积极作用,构建了基因在米曲霉中过量表达的载体,载体上带有红色荧光,便于对基因表达进行定位。采用农杆菌Ti质粒介导法转化米曲霉,进行基因表达定位及菌株胁迫耐受性实验。结果显示,AoD9D1基因在米曲霉中过表达定位于细胞膜上,基因过表达菌株显示出比野生型更强的繁殖能力和盐胁迫耐受性。4.AoD9D1基因作用的转录调控机制研究:利用STRING数据库预测出10个与AoD9D1基因编码去饱和酶存在相互作用的蛋白。进行相关载体构建,通过酵母双杂交系统对AoD9D1基因作用转录调控机制进行研究。结果显示,无机磷酸盐转运蛋白和肽酰脯氨酰顺反异构酶与AoD9D1基因所编码的蛋白存在着蛋白之间的相互作用。