组织工程产品的体积达到数立方毫米以上时,其内部的细胞将难以通过渗透作用获得营养和氧分的支持,而必须要求毛细血管的长入才能维持其正常的代谢,否则移植后由于宿主血管未及时长入而致营养和氧气供应的不足,使生物支架内细胞死亡,最终导致移植失败。为了克服这个问题,体积较大的组织工程产品在移植于宿主之前必须具有为细胞提供营养和气体交换的血管结构。一个行之有效的的方法是将血管内皮细胞与组织种子细胞共同接种于支架材料上,使构建的组织工程产品在移植前自身携带血管结构。尽管这种方法显示出良好的应用前景,但是血管内皮细胞在支架材料上存活率低、易凋亡,很难形成功能性血管结构来维持移植物中细胞的营养供给和氧气交换。因此,本研究拟通过使用脱细胞真皮基质支架材料和极低频电磁场处理改善血管内皮细胞生存的微环境,提高其存活能力和形成功能性的血管结构来解决组织工程产品移植宿主体内营养供给问题,以期为体积较大、结构复杂的组织工程产品最终临床应用探寻一条新的研究途径。实验分为三部分:1.异种脱细胞真皮基质及其颗粒微载体的制备与相关性能研究为了验证经胰蛋白酶、NaOH和反复冻融法制备猪的脱细胞真皮基质支架作为体内植入物的安全性,检测支架材料中α-半乳糖、DNA残余量、内源性生长因子、以及细胞和组织相容性;并将这种脱细胞真皮基质制成颗粒状微载体,检验其对组织工程皮肤种子细胞的体外扩增能力以及扩增过程中形成的细胞-微载体复合物对裸鼠皮下组织填充和皮肤缺损愈合效果。结论:①利用胰蛋白酶、NaOH和反复冻融法制备的异种脱细胞真皮基质不表达α-半乳糖抗原、DNA残余量较少、具有良好的生物相容性并且含有内源性的细胞生长因子bFGF和TGF-β,具有作为组织工程支架材料的可能性。②脱细胞真皮基质微载体可以有效地扩增成纤维细胞,而且在扩增过程中可以形成组织工程微粒皮肤,这种微粒皮肤可以充当软组织的填充物以及难愈性皮肤创面的移植物。2.脱细胞真皮基质微环境对脐静脉血管内皮细胞形成血管结构的影响为了验证脱细胞真皮基质微环境是否适合血管内皮细胞的增殖和血管结构的形成,本实验采用酶消化法,获取原代脐静脉血管内皮细胞,与脱细胞真皮基质材料直接复合培养。结果显示:脱细胞真皮基质促进血管内皮细胞的增殖,支持血管内皮细胞在其微环境中形成管腔样结构。这提示脱细胞真皮基质材料复合血管内皮细胞可以作为血管化的支架构建体积较大、结构复杂的组织工程产品如肝脏、肾脏和心肌组织。3.极低频电磁微环境对新生血管形成作用的实验研究考虑到机体内广泛存在内源性电磁场,本研究提出了一种全新的“应用外源性电磁处理”构建组织工程产品血管化的策略,从单细胞、细胞共培养以及三维组织三个层次验证电磁微环境能够促进新生血管的形成。首先,检测极低频电磁场对血管内皮细胞增殖、凋亡、迁移、在Matrigel基质中形成管腔结构的能力和细胞外基质分泌的影响,以证明经极低频电磁场处理的血管内皮细胞容易形成血管结构;其次,检测极低频电磁场对脐静脉血管内皮细胞和成纤维细胞共培养体系的血管形成的影响,以及将极低频电磁场处理的脐静脉血管内皮细胞和成纤维细胞共培养体系移植于裸鼠皮下,术后1周检测移植物中新生血管形成情况;然后,以胶原和第一部分制作的脱细胞真皮基质为材料复合血管内皮细胞和成纤维细胞构建组织工程真皮,经极低频电磁场处理后,检测组织工程真皮中血管形成情况;最后,将含血管结构的组织工程真皮移植于裸鼠皮肤缺损模型上,检测新生皮肤中血管结构形成情况。结论:①极低频电磁场促进血管内皮细胞增殖、迁移,抑制细胞凋亡,促进在Matrigel基质中形成稳定的管腔样结构以及促进细胞对细胞外基质成分中ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ、VCAM和bFGF的mRNA表达。②极低频电磁场不仅促进血管内皮细胞和成纤维细胞共培养体系形成血管结构,而且有利于共培养体系形成功能性血管结构与宿主血管相吻合。③极低频电磁场促进以胶原和脱细胞真皮基质为材料的组织工程真皮中血管结构的形成。④经极低频电磁场处理的组织工程真皮形成的血管结构更容易与宿主血管相吻合。综上所述,本研究成功制备一种免疫原性低、具有良好生物相容性以及含有内源性细胞生长因子的脱细胞真皮基质材料,其微环境促进血管内细胞的增殖和形成血管样结构。极低频电磁场处理不仅可以促进血管内皮细胞形成血管结构,而且形成的血管结构能够与宿主自身的血管结构相吻合。本研究所采用的脱细胞真皮基质材料和极低频电磁场处理的方法为成功构建体积较大、结构复杂的组织工程产品的血管化探索了一条的新途径。