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CD8分子是T淋巴细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,也是T淋巴细胞重要的表面标志物,它作为粘附分子、辅助受体和免疫调节物广泛参与TCR对MHC分子递呈抗原的识别和信号传递。CD8分子做为一类信号传递受体,其分子胞质部分与非受体型蛋白酪氨酸激酶Src家族p56lck相连,参与TCR介导的信号级联反应。CD8aa同型二聚体分子在小鼠肠上皮下与非典型MHCⅠ类分子作用,构成肠道免疫屏障。为了解这种膜蛋白分子在机体特异性免疫应答中的作用及其机理,本研究进行了猪CD8a基因的克隆、原核表达和多克隆抗体的制备。首先,根据GenBank登录的猪CD8a基因序列设计一对引物,从猪脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出一条特异性基因片段,经单酶切鉴定,与GenBank中登录的猪CD8a基因序列含有相同的单酶切位点。将其连接到pMD18-T载体后进行序列测定。结果表明本实验成功地克隆猪CD8a基因,它由711个核苷酸组成,编码237个氨基酸。所克隆的猪CD8a基因与GenBank中登录的猪CD8a基因相比较,有6个核苷酸的差异,分别导致4个氨基酸的变化,同源性为99.2%。其次,根据本实验测定的猪CD8a基因序列和原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点序列设计一对引物,应用PCR技术从重组质粒pMD18-T-CD8a中扩增出编码猪CD8a前体蛋白的基因。PCR产物分离纯化后连接到原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点,经质粒PCR鉴定和EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆,构建成CD8a基因的原核表达质粒pGEX-4T-1-CD8a。将这种原核表达重组质粒转化大肠杆菌BL21,经0.6mmol/L IPTG的诱导在37℃表达,SDS-PAGE凝胶电泳表明所克隆的基因片段在大肠杆菌中得到表达,表达产物是以包涵体的形式存在的融合蛋白GST-CD8a,且所获得的融合蛋白分子量约为52 KD,与预期结果相符。最后,通过优化原核表达条件,确定了重组质粒pGEX-4T-1-CD8a的原核表达最佳诱导时间和诱导剂浓度,并用优化后的条件对含有pGEX-4T-1-CD8a质粒的BL21菌进行了大量诱导表达。使用反复冻融和超声方法来裂解表达菌,结合十二烷基肌氨酸钠法,提取了大量的可溶性GST-CD8a融合蛋白。在对目标蛋白进行复性和亲和层析纯化之后,用其免疫小鼠,制备了针对该蛋白的鼠多克隆抗体,ELISA和WesternBlotting证明所制备的多克隆抗体具有免疫活性和生物学活性。综上所述,本研究成功地克隆了猪CD8a基因,对其进行了原核表达,获得了大量的GST-CD8a融合蛋白,并制备了针对该融合蛋白的多克隆抗体,这些都为进一步研究猪CD8a分子免疫学功能及其应用提供了试验材料。恒定链（invariant chain,Ii）是一种非多态性Ⅱ型跨膜糖蛋白,主要表达于哺乳动物和禽类的体细胞表面,如B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、胸腺上皮细胞等。Ii链作为MHCⅡ类分子的伴侣蛋白,它主要有以下功能:辅助MHCⅡ类分子在内质网中进行正确折叠并迁移出内质网;提供MHCⅡ类分子进入内体/溶酶体的靶信号;阻止MHCⅡ类分子与内质网的内源性抗原结合。因此,Ii链在MHCⅡ类分子呈递外源性抗原给CD4+T淋巴细胞的过程中起着关键性作用,对于机体的免疫应答具有重要意义。目前钓取未知基因的cDNA序列并克隆其全长的方法主要有两种,分别是:cDNA文库筛选法和快速cDNA末端扩增法（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）。cDNA文库筛选法烦琐、工作量大、费用昂贵;而RACE技术灵敏、快速。鉴于Ii基因在免疫学中具有重要的意义及RACE法在钓取未知基因中的优越性,我们采用RACE法,首次成功钓取了鸽子Ii基因,分析比较禽Ii链在进化上的保守性,初步探讨了鸽Ii链的功能和性质。根据GeneBank登录的禽类及哺乳动物的Ii链基因cDNA序列,用CodenHOP5设计一对简并引物,用于扩增鸽Ii链中保守性最高的区域;在该保守区中设计3′RACE的上游引物,结合mRNA在3′端具有Poly尾的特点,使用3′RACE试剂盒扩增鸽Ii链的3′端;再以鸽Ii链的3′端核酸序列为模版设计一条磷酸化引物和3条半套式PCR引物,采用5′RACE试剂盒扩增鸽Ii链的5′端。之后将3′RACE和5′RACE扩增的结果用软件拼接初步得出全序列,依照拼接结果设计全序列上、下游引物,扩增克隆了鸽Ii链的全长cDNA基因。序列分析结果表明,鸽Ii基因全长cDNA序列为1050bp（登录号:AY904337）,它与哺乳动物的Ii链功能区相似,在胞浆区有一个长为26个氨基酸且变异较大的CLIP区,一个能使Ii分子聚合形成同源三聚体的三聚体区。其核酸序列与鸡Ii链同源性达到82.8%,与人等其它动物的同源性在52.0%以上,而且大多数发挥重要生物学功能的氨基酸残基保守性较高。综上所述,本研究成功地采用RACE法克隆了鸽Ii基因,并进行了序列和蛋白功能区比对分析,这些为进一步研究鸽Ii免疫学功能奠定了实验基础。