论文部分内容阅读
研究目的自1979年p53基因被发现以来,其结构与功能已被广泛认知,其转录后编码的p53蛋白已成为肿瘤细胞发生发展过程中重要的参与者。在100多种人类肿瘤中,有60%以上的肿瘤发生与p53基因突变有关,目前已知人乳腺癌p53基因突变率为20%,而其余80%的乳腺癌均含有野生型的p53,与胃癌、大肠癌、肺癌等肿瘤类型不同,乳腺癌发生和发展的原因除了抑癌基因p53的基因突变外,大部分是由于基因序列正常的p53(野生型p53)没有发挥应有的作用所致。通过腺病毒载体将外源性肿瘤抑制基因(p53基因)导入肿瘤内,通过细胞凋亡、旁观者效应、抑制多药耐药基因表达等多种抗肿瘤机制,抑制肿瘤组织的生长,促进肿瘤细胞的凋亡,已成为一种新的肿瘤治疗方向。p53和雌激素受体(ER)都是乳腺癌发生发展重要的因子,研究发现,p53能促进ER表达,反过来,ER可拮抗p53的促凋亡作用,抑制p53介导的细胞凋亡反应。氟维司群(fulvestrant)是全新的乳腺癌内分泌治疗药物,称为选择性雌激素受体下调剂(Selective Estrogen Receptor Downregulators, SERDs),能够高亲和力地结合阻断并下调雌激素受体(ER)的数量,使激素受体上的转录活性区域AF1和AF2均失活,并加速了雌激素受体功能的丧失。我们通过联合应用重组人p53腺病毒和氟维司群,观察乳腺癌细胞系MCF-7的形态学变化、p53蛋白和ER蛋白的表达水平、MCF-7细胞的凋亡情况以及增殖抑制率等,探讨氟维司群是否能阻断并下调ER,解除其对p53的抑制作用,观察两者是否具有协同作用,为基础研究与临床乳腺癌治疗的新方法开拓新的方向。研究方法1. 比较各组细胞的生长及形态学变化：设对照组(空载病毒组)、氟维司群(1μmol/1)组、Ad-p53 (50MOI)组、Ad-p53 (50MOI)+氟维司群(1μmol/l)组作用于MCF-7细胞72h后,倒置显微镜观察不同实验组细胞的生长情况以及形态学变化。2. 比较各组细胞的增殖抑制率：设对照组(空载病毒组)、氟维司群(1μmol/l)组、Ad-p53 (50MOI)组、Ad-p53 (50MOI)+氟维司群(1μmol/l)组作用于MCF-7细胞72h后,比较各实验组细胞的增殖抑制率。3. 比较各组细胞的凋亡率：设对照组(空载病毒组)、氟维司群(1μmol/l)组、Ad-p53 (50MOI)组、Ad-p53 (50MOI)+氟维司群(1μmol/l)组作用于MCF-7细胞72h后,用流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双标法检测分析不同处理组MCF-7细胞的凋亡情况。4. 比较各组细胞p53和ER蛋白的表达水平：设对照组(空载病毒组)、氟维司群(1μmol/l)组、Ad-p53 (50MOI)组、Ad-p53 (50MOI)+氟维司群(1μmol/l)组作用于MCF-7细胞72h后,检测各实验组细胞p53和ER蛋白的表达情况。研究结果1.倒置显微镜观察细胞生长状态：对照组MCF-7细胞正常贴壁生长,培养基清澈无浑浊,细胞生长状态佳,氟维司群组细胞贴壁生长可,培养基稍浑浊,出现一定的悬浮细胞；Ad-p53组可见贴壁细胞生长状态不佳,细胞密度较低,细胞形态不规则,出现细胞碎片、细胞脱落等细胞凋亡的改变；Ad-p53与氟维司群联合作用于MCF-7细胞后,高倍镜下可见散在生长细胞,密度较低,贴壁细胞数量大幅减少,细胞出现皱缩,悬浮细胞数目更多,细胞培养液出现浑浊。2.流式细胞术检测细胞凋亡结果：对照组、氟维司群组、Ad-p53组、 Ad-p53+氟维司群组中细胞凋亡率分别是(6.3±1.5)%、(13.3±1.2)%、(14.5±2.9)%和(38.1±5.9)%。3.MTS法检测细胞增殖抑制率结果：50 MOI Ad-p53和氟维司群分别处理MCF-7细胞24"96 h后,增殖抑制率分别为(8.21±0.54)%、(28.5±1.42)%、(50.14±0.78)%、(58.25±2.92)%和(9.73±1.68)%、(25.26±0.82)%、(35.25±3.94)%、(46.37±2.56)%；氟维司群与Ad-p53联合作用24～96h后,细胞的增殖抑制率为(12.42±1.76)%、(35.20±0.58)%、(62.08±2.56)%及(75.43%±3.56)%。4.蛋白印迹法(Western blot)检测结果：对照组、氟维司群组中均有p53蛋白的低表达；Ad-p53组、Ad-p53+氟维司群组中p53蛋白高表达；与对照组相比,Ad-p53组细胞的ER蛋白表达增加,但是联合用药组ER蛋白表达降低。研究结论1.Ad-p53感染乳腺癌MCF-7后,细胞生长缓慢且形态学发生明显改变,且当与氟维司群联合使用时细胞生长几乎停止,细胞密度极低,调亡细胞更多,细胞碎片更多,细胞凋亡现象更明显。2.Ad-p53或氟维司群单独作用乳腺癌MCF-7细胞后,MTS法检测细胞的各时期增殖抑制率均增加；当Ad-p53与氟维司群联合作用于MCF-7细胞,24～96 h的各时期MCF-7细胞的增殖抑制率均高于各单药组。3.Ad-p53或氟维司群单药均可明显诱导乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡增加,联合用药组诱导细胞凋亡作用更加明显。4.对照组、氟维司群组中均有p53蛋白的低表达；Ad-p53组、Ad-p53+氟维司群组中p53蛋白高表达,说明腺病毒介导的p53基因成功转入MCF-7细胞中并有效表达,但是Ad-p53组和联合组蛋白表达没有明显差异；与对照组相比,Ad-p53组细胞的ER蛋白表达增加,但是联合用药组ER蛋白表达降低。