论文部分内容阅读
为探究氧阴离子洞结构对扩展青霉脂肪酶的底物选择性的影响,本研究采用体外构建高拷贝重组载体的方法,将实验室课题组已经筛选出来的氧阴离子洞结构突变体进行重组载体的构建、转化及表达,最后检测分析了突变体脂肪酶在催化活性方面的变化。研究内容包括以下几点:1.脂肪酶突变体基因的扩增设计L133M、L133A、H131E/L133A,3种突变体脂肪酶的引物,进行质粒PCR,并转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3),挑选转化子进行测序验证。2.多拷贝重组载体的构建将PEL与载体pA0815连接并转化,获得单拷贝重组表达载体pA0815-m-PEL。酶切获得单拷贝表达盒,并将其与单拷贝重组载体进行连接及转化。获得两拷贝表达载体pA0815-m-2PEL。同理得到pA0815-m-3PEL，pA0815-m-4PEL重组质粒载体。3.脂肪酶突变体在毕赤酵母中的表达及其酶学性质的研究将四拷贝重组质粒表达载体pA0815-m-4PEL,转化到毕赤酵母感受态细胞GS115。经过初筛、复筛鉴定,得到多拷贝酵母工程菌GS-pA0815-m-4PEL。将筛选获得的酵母转化子进行发酵表达,并检测分析突变型脂肪酶在催化活性及底物选择性等方面性质的变化。(1)检测野生型脂肪酶(WT)与突变体L133M、L133A、H131E/L133A对5种不同链长底物(4-硝基苯基丁酸酯、4-硝基苯基已酸酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯、4-硝基苯基棕榈酸酯)的比活力。测定结果显示:脂肪酶突变体L133M、L133A、H131E/L133A对4-硝基苯基丁酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.75倍、2.61倍、2.25倍;对4-硝基苯基已酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.72倍、2.27倍、1.93倍;对4-硝基苯基辛酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.45倍、1.51倍、0.96倍;对4-硝基苯基月桂酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.84倍、3.93倍、5.53倍;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.59倍、9.42倍、8.82倍。(2)检测野生型脂肪酶(WT)与突变体L133M、L133A、H131E/L133A对手性化合物(R,S)-扁桃酸乙酯的底物选择性及催化活性。测定结果显示:脂肪酶突变体L133M、L133A、H131E/L133A对R-扁桃酸乙酯的比活力分别是野生型脂肪酶的1.89倍、11.1倍、13.2倍。对S-扁桃酸乙酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.68倍、0.70倍、0.62倍。与野生型脂肪酶相比,突变体L133A、H131E/L133A表现出“新”的底物选择性,对手性化合物(R,S)-扁桃酸乙酯表现出较好的对映选择性。