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目的:本实验旨在探讨在体外原代培养大鼠肝癌细胞与大鼠胚胎肝细胞的基础上,利用基因芯片技术研究两者之间microRNA(miRNA)表达的差异谱,为进一步研究miRNA在肝细胞癌变发生机制中的作用提供新线索。方法:1.取体重150～200g雄性近交系F334大鼠150只,随机分为实验组和对照组,利用化学致癌剂二乙基亚硝胺(DEN)建立起近交系F334大鼠肝癌模型。2.分别取大鼠肝癌组织及胚龄(ED)14d大鼠胚胎肝脏组织,将其修剪成1mm~3左右大小的小块,利用胶原酶法进行原代培养。经传代培养至细胞对数生长期、80 %融合状态时收获107细胞,再对两者细胞的RNA进行提取、分离和标记。3.将带有荧光标记的RNA进行基因芯片的杂交、清洗和扫描,得到芯片杂交图谱。利用Genepix软件对芯片杂交图谱进行数据抓取,再对实验数据使用SAM 3.0软件进行差异显著性分析。结果:1.利用0.15%DEN连续饮水12周后,成功建立起近交系F334大鼠肝癌模型。大体解剖后发现肝脏质地较硬、满布大小不等的癌结节(图1 A)。HE染色结果符合肝癌病理改变,肝小叶结构被破坏,各种异常的肝细胞构成增生结节并且伴有纤维结缔组织的增生(图1 B)。2.原代接种24 h后可见由3-5个细胞组成的上皮样细胞克隆,7d后发现由大量细胞形成稳定的克隆团块,形态呈多边形,边缘清晰明确(图1 C)。利用Trizol一步法提取细胞中的总RNA,通过异丙醇沉淀法浓缩RNA,用紫外分光光度计定量。根据RNA在A260/280值≥1.7,以及甲醛变性凝胶电泳28s、18s rRNA条带清晰,亮度比值接近2:1(见图9),满足miRNA芯片实验的要求。3.利用Genepix软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号。再用SAM 3.0软件进行数据处理,可以看出miRNA在大鼠肝癌细胞与胚胎肝细胞中的差异性表达(见图10)。miRNA芯片共获得78个差异表达的miRNAs,其中68个表达上调(fold change>2),10个表达下调(fold change<0.5),部分miRNAs与肿瘤关系密切,其中hsa-miR-21为肝癌癌变相关miRNA。结论:从miRNA基因芯片结果中我们总共获得78个差异表达的miRNAs,这充分说明miRNAs在肝癌发生、发展上的时序性表达差异明显,也就是说miRNAs在肝幼稚细胞向肝癌细胞演变过程中起着十分重要的作用。其中,大鼠肝癌细胞中上调的miRNA较下调的数量多(68:10),这恰恰提示了可能是大鼠肝癌细胞中的抑癌基因表达大量减少,癌基因表达增强,从而导致了细胞癌变的发生。与此同时,我们还利用生物信息学方法(molecule annotation system,MAS)预测miRNA在转录后或翻译水平的靶基因,发现hsa-miR-21与基质金属蛋白酶(MMPs)抑制因RECK、TIMP3的表达关系密切。hsa-miR-21的高表达抑制RECK、TIMP3抑制因子的表达,从而使得MMPs表达上调,而MMPs的大量表达在肝癌的生长、侵袭及转移等过程中都起着非常重要的作用。