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背景及目的:肝癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均位居前列,我国是肝癌高发国家之一,其新发和死亡病例数约占全球一半。肝癌早期不易发现,就诊时多处于中晚期,治疗困难,转移和复发是影响其预后的主要因素,因此寻找肝癌生物标志物包括肿瘤易感基因和转移相关基因等成为肿瘤研究的热点。本课题组前期实验已经证实了 NDRG1能够抑制肝癌细胞株BEL7402细胞侵袭迁移能力,NDRG1发挥抑癌作用的分子机制是本研究的重点。本项目旨在寻找NDRG1调控的肿瘤转移相关下游基因,并探索NDRG1通过Smad2/3通路调控整合素β3(ITGB3)的表达进而影响BEL7402细胞侵袭迁移能力的分子机制,为肝癌侵袭转移提供新的线索。方法:1、通过PCR Array实验检测敲低NDRG1基因表达后肝癌细胞株BEL7402细胞和SMMC7721细胞中mRNA表达发生变化的肿瘤转移相关基因,寻找NDRG1发挥作用的可能下游基因。2、应用Western Blot实验验证在BEL7402细胞和SMMC7721细胞中敲低NDRG1基因后可能下游基因的蛋白表达变化,锁定ITGB3基因继续进行深入研究。3、Real-Time PCR检测肝癌细胞系中ITGB3 mRNA表达情况,利用siRNA技术敲低BEL7402细胞中ITGB3基因的表达,并利用Real-Time PCR和Western Blot实验验证其敲低效果。4、在 BEL7402 细胞中共转染 sh-NDRGl 和 si-ITGB3 后,利用 Transwell迁移和侵袭实验验证整合素β3对NDRG1功能发挥的影响。5、Western Blot 实验检测在 BEL7402 细胞中敲低 NDRG1 后,TGF-β/Sma d通路关键分子Smad2、Smad3及其磷酸化蛋白p-Smad2、p-Smad3的表达变化。6、向转染了 sh-NDRGl的BEL7402细胞中加入TGF-β/Smad通路抑制剂SB431542,Western Blot实验验证SB431542对NDRG1引起的整合素β3蛋白表达变化的影响,Transwell迁移和侵袭实验验证SB431542对NDRG1抑制BEL7402细胞迁移和侵袭能力的影响。7、在BEL7402细胞中分别转染si-Smad2、si-Smad3或通路共同调节蛋白si-Smad4,Real-Time PCR和Western Blot实验验证siRNA对目标基因的干扰效果,并进一步分别共转染sh-NDRG1及si-Smad2、si-Smad3或si-Smad4,验证TGF-β/Smad通路关键蛋白分子分别对NDRG1调控整合素β3表达的影响。结果:1、PCR Array 实验表明敲低 NDRG1 基因后,CTSL1、IL-1β、ITGB3、MMP10、SERPINE1基因在BEL7402细胞中表达显著升高,MMP13、TNFSF10 基因表达减少;而在 SMMC7721 细胞中,ETV4、ITGB3、MMP10、SERPINE1基因的表达量增加,CDH6、TNFSF10基因的表达量降低。2、Western Blot实验证实,NDRG1敲低72h后,BEL7402细胞及SMMC7721细胞中整合素β3蛋白表达均上调。3、ITGB3 mRNA在BEL7402细胞中的内源性表达量最高,其次是HepG2细胞,在SMMC7721细胞中表达量最低;Real-Time PCR和Western Blot实验结果表明si-ITGB3能有效干扰BEL7402细胞中整合素β3的表达。4、Transwell迁移和侵袭实验结果说明敲低ITGB3后sh-NDRG1诱导的BEL7402细胞迁移和侵袭能力的增强被显著抑制,NDRG1可能通过干扰整合素β3的表达抑制BEL7402细胞的迁移和侵袭能力。5、Western Blot 实验表明敲低 NDRG1 基因后,Smad2、p-Smad2 及 p-Smad3的表达上调。6、通路抑制剂SB431542能够阻碍sh-NDRG1介导的BEL7402细胞中整合素β3的上调,并且能够阻碍NDRG1对BEL7402细胞迁移和侵袭能力的调控,说明NDRG1可能通过TGF-β/Smad通路发挥抑制BEL7402细胞的迁移和侵袭能力的作用。7、Real-Time PCR 和 Western Blot 实验表明 si-Smad2、si-Smad3 及 si-Smad4均能有效干扰相应目标基因mRNA和蛋白的表达,且分别敲低Smad2、Smad3及Smad4均能阻碍NDRG1对整合素β3的调控作用,进一步证实了NDRG1可能通过抑制BEL7402细胞中Smad2/3通路而阻碍整合素β3的表达。结论:1、敲低BEL7402和SMMC7721肝癌细胞中的NDRG1基因后,ITGB3表达显著升高。2、NDRG1通过干扰整合素β3的表达抑制BEL7402细胞的侵袭和迁移能力。3、NDRG1通过抑制BEL7402细胞中Smad2/3通路而阻碍整合素β3的表达。