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前言胰腺癌常伴随广泛的侵袭和／或转移,以至于无法进行根治性外科手术治疗。开发以侵袭转移相关因子为靶点的新型分子靶向治疗方法为改善胰腺癌患者预后提供了新的治疗手段。但目前胰腺癌侵袭转移的细胞及分子机制尚未完全阐明。在前期研究中,利用BOP诱导的叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模型,建立了非解离型低转移株胰腺癌细胞系(PC-1),再将PC-1细胞经皮下种植后,取转移癌建立了解离型高转移株胰腺癌细胞系(PC-1.0),而这两种同源细胞具有明显不同的侵袭和转移能力。前期研究中我们利用mRNA差异表达法(Representational Difference Analysis, RDA)发现PC-1.0和PC-1 mRNA表达存在明显差异,其中MEK2是与PC-1.0和PC-1细胞侵袭转移密切相关的因子之一。进一步研究中证实MEK2参与调控胰腺癌细胞的侵袭转移过程。MEK2作为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号转导通路中的重要激酶分子,参与调控多种细胞生理学功能,包括细胞增殖、分化,细胞分裂,应激和凋亡。而MAPK信号转导通路几乎存在于所有真核生物细胞中,为三级激酶体系：MAPK,丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAP kinase kinase, MKK或MEK)和丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP kinase kinase kinase, MAPKKK)。MEK1和MEK2是MEK家族的两个成员,通常表示为MEK1／2。二者拥有85%相同的基因序列,通常被认为具有类似的生物学功能,但也有文献报道二者可能通过不同途径调控细胞的生理功能。此外,在胰腺癌细胞侵袭转移中MEK1和MEK2的作用机制尚未明确。目的通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术诱导PC-1.0细胞中MEK1和MEK2基因表达沉默,并建立相应稳定转染的PC-1.0亚细胞克隆,以进一步明确MEK1和MEK2在胰腺癌细胞中对生物学功能差异调节及其分子机制。材料与方法一、材料利用仓鼠解离型高转移株胰腺癌细胞(PC-1.0),以RPMI-1640培养液培养,并加10%胎牛血清、100 U／ml青霉素G和100μg／ml链霉素,于含5%CO2 37℃孵箱内培养。上述细胞在进行免疫细胞学实验前无血清培养。利用RNAi设计软件(Clontech Laboratories, Inc., CA, USA)针对MEK1和MEK2基因序列设计shRNA序列。利用RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-Zsgreen质粒构建MEK1和MEK2 shRNA。利用GP2-293包装细胞感染PC-1.0细胞,建立MEK1和MEK2 shRNA稳定转染的亚细胞克隆。利用荧光显微镜对细胞进行筛选。利用兔抗人MEK1、MEK2及β-actin多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)作为一抗。利用辣根过氧化物酶结合的抗体和FITC标记的荧光抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)作为第二抗体。二、方法利用基因敲减(knock down)技术分别抑制MEK1和MEK2 mRNA表达。应用RT-PCR、Western blot对MEK1及MEK2基因敲减的PC-1.0胰腺癌亚细胞克隆进行筛选。对筛选出的MEK1及MEK2 mRNA表达抑制最明显的PC-1.0胰腺癌亚细胞克隆进行体外细胞增殖、细胞周期、体外侵袭及细胞形态学研究。实验结果一、表达MEK1 shRNA或MEK2 shRNA的质粒及稳定转染MEK1 shRNA或MEK2 shRNA的胰腺癌亚细胞克隆的建立为了抑制内源性MEK1或MEK2的表达,我们利用RNAi设计软件分别通过设计了三种MEK1及MEK2 shRNA序列。通过RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-Zsgreen质粒建立稳定转染MEK1 shRNA或MEK2是RNAde胰腺癌亚细胞克隆,发现所选择的shRNA均分别降低内源性MEK1或MEK2 mRNA表达,其中抑制最明显的分别是转染MEK1 shRNA 3的亚细胞克隆(98.4%)和转染MEK2 shRNA 3的亚细胞克隆(77.5%)。在蛋白水平上,转染MEK1 shRNA3和转染MEK2 shRNA 3的PC-1.0亚细胞克隆中MEK1和MEK2的蛋白表达较对照组明显降低。对上述MEK1和MEK2基因敲减的PC-1.0亚细胞克隆进行原代培养,建立相应的PC-1.0亚克隆细胞系以进行下一步实验。二、MEK1和MEK2基因敲减的PC-1.0细胞的形态学和生长方式变化MEK2基因敲减的PC-1.0细胞以细胞克隆方式生长。而MEK1基因敲减的细胞在细胞生长方式方面较对照组PC-1.0细胞无明显变化。三、MEK1和MEK2基因敲减的PC-1.0细胞的增殖变化MEK1基因表达下调抑制PC-1.0细胞的增殖。在培养48小时和72小时后,PC-1.0细胞增殖活性显著减低,与对照组细胞相比抑制率分别为62.0%(P<0.05)和60.5%(P<0.05)。而MEK2基因表达下调的PC-1.0细胞与对照组细胞相比无统计学差异(P>0.05)。四、MEK1和MEK2基因敲减的PC-1.0细胞的细胞周期变化应用流式细胞仪(FACScan, BD,USA)对MEK1和MEK2基因敲减的PC-1.0细胞进行细胞周期分析。在MEK1基因敲减细胞中,我们发现只有8.1%±0.7%的细胞处于有丝分裂的S期。而对照组PC-1.0细胞中有26.6%±5.4%的细胞处于S期(P<0.05),且与MEK2基因敲减细胞相比无显著差异(P>0.05)。五、MEK1和MEK2基因敲减的PC-1.0细胞的体外侵袭能力变化对照组细胞表现为较强的体外侵袭能力(侵袭细胞数=52.6±5.8)。而与对照组相比,MEK2基因敲减显著抑制了PC-1.0细胞的侵袭能力(侵袭细胞数=20.1±3.1,P<0.05)。MEK1基因表达下调对于PC-1.0细胞的侵袭能力没有显著抑制作用(侵袭细胞数=48.4±4.3,P>0.05)。结论1、在胰腺癌细胞中MEK1和MEK2调节不同的生物学功能。MEK1调控胰腺癌细胞的细胞周期变化,而MEK2调控胰腺癌细胞的体外侵袭能力和形态学变化。2、MEK1和MEK2可作为胰腺癌分子靶向治疗的新靶标。