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研究背景作为消化系统最常见的恶性肿瘤之一,胃癌的死亡率在一直居高不下。目前药物治疗效果不好,临床上有效的治疗手段仍是手术治疗。然而,有一半以上的患者在行胃癌根治术后出现了局部复发或者远处转移。其中腹腔转移复发最常见,并且往往是致死性的。腹腔脱落癌细胞,在胃癌腹腔转移中发挥重要作用。腹腔脱落胃癌细胞通常以两种形式存在,一为散在的、单个游离癌细胞,二为以多个细胞相互粘连形成多细胞团簇或多细胞球(multicellular aggregates,MCAs)。研究发现腹腔散在的、单个游离癌细胞通常发生失巢凋亡(anoikis),而MCAs具有抗失巢凋亡能力,能够在乏氧的腹腔微环境中生长、增殖,可能是胃癌腹腔转移的真正“种子”细胞。所以,揭示胃癌MCAs抗“失巢凋亡”的分子机制对胃癌腹腔转移防治具有重要意义。原癌基因c-Src是1976年发现的第1个细胞癌基因,它的表达产物Src蛋白属于Src家族激酶(SFKs)成员,也是最早发现的与人类疾病密切相关的一种非受体依赖性酪氨酸蛋白激酶。Src基因在调控细胞的生长、发育、分化和其他生物学功能方面具有重要作用。在细胞癌变中,其蛋白产物在多种肿瘤细胞中高度活化或过量表达,且从癌细胞中分离出来的src基因具有较强的改变正常细胞生物特性的能力。目前的研究发现c-Src蛋白参与细胞内很多重要的信号通路,与胃癌的发生、发展、预后关系密切。如c-Src蛋白具有促进胃癌细胞增殖、促进肿瘤血管生成、参与胃癌细胞粘附和侵袭、通过生长因子受体与生长因子相互作用共同调节肿瘤生长等作用。既往已有多项研究表明,胃癌组织中Src表达明显上调。然而它在胃癌腹腔转移多细胞团簇抗失巢凋亡中是否发挥重要作用,目前国内外未见报道。研究目的分离鉴定胃癌腹腔转移患者腹水中的胃癌MCAs,同时检测腹水中胃癌多细胞团簇和散在的胃癌细胞中Src的表达情况。检测Src在体外三维培养的MCAs和贴壁培养的胃癌细胞的表达水平,研究Src沉默对体外三维培养的胃癌MCAs增殖及功能的影响,初步探讨Src与胃癌多细胞团簇抗失巢凋亡的关系及其对肿瘤多细胞团簇的生物学功能的影响,为胃癌腹腔转移的临床防治提供分子生物学理论依据。研究方法1、收集化疗初治的腹腔转移胃癌患者的腹水,用BD公司生产的40μm细胞滤器过滤腹水(未被过滤留在上层为多细胞团簇,被滤出到下层的为散在癌细胞),分离其中的胃癌多细胞团簇,收集滤出的散在游离癌细胞,离心留沉淀备用。将留在滤器上层的多细胞团簇用PBS冲洗到离心管中,离心,弃上清,取细胞沉淀加入到装有10%的福尔马林的收集管中固定,固定好后进行石蜡包埋切片。对制好的切片进行HE染色。2、应用qRT-PCR检测腹水中胃癌MCAs和散在游离癌细胞的src表达情况。3、选取人胃腺癌细胞BGC823和MKN45进行体外三维培养用来模拟腹水中的胃癌多细胞团簇。三维培养方法详见材料与方法部分。4、Western blot检测体外三维培养的MCAs和单层贴壁细胞的src蛋白表达情况。5、应用分子生物学技术,构建Src慢病毒载体,感染胃癌BGC823和MKN45后筛选稳定感染细胞进行体外三维培养。研究抑制Src表达对胃癌细胞BGC823MCAs和MKN45 MCAs形态学的影响,采用CCK8检测抑制Src表达对胃癌BGC823MCAs和MKN45 MCAs细胞活力的影响。6、应用流式细胞术检测抑制Src表达对胃癌BGC823 MCAs和MKN45 MCAs细胞凋亡的影响。采用Western blot检测抑制Src表达对胃癌BGC823和MKN45 MCAs细胞凋亡相关蛋白表达的影响。研究结果:1、成功从胃癌腹腔转移患者腹水中分离胃癌MCAs。HE染色结果进一步证实腹腔转移患者腹水中存在肿瘤多细胞团簇。2、Real-time PCR结果表明:腹水中胃癌MCAs中Src的表达水平明显高于散在游离的胃癌细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。3、利用BGC823和MKN5成功建立胃癌多细胞团簇的体外三维培养模型,可用来模拟腹水中的胃癌多细胞团簇进行体外试验。4、Western blot结果表明:体外三维培养的胃癌MCAs中Src的表达水平明显高于单层贴壁培养的胃癌细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。5、成功构建了Src慢病毒载体(由上海吉凯生物公司完成)。抑制胃癌细胞BGC823和MKN45中Src的表达,可以明显降低其形成多细胞团簇的能力,并明显影响MCAs的活力。6、流式细胞术实验结果表明抑制Src的表达可以显著诱导BGC823 MCAs和MKN45 MCAs发生凋亡。Western blot结果表明抑制Src的表达后,胃癌MCAs促凋亡蛋白caspase-3表达明显上调,抗凋亡蛋白bcl-2表达明显下调。结论:1、本研究成功的从胃癌腹腔转移患者腹水中成功分离、鉴定出胃癌MCAs。首次证实胃癌腹腔转移MCAs作为独立的功能单位,具有抗“失巢凋亡”能力,是胃癌腹腔转移的“种子”细胞。2、原癌基因c-Src表达产物Src蛋白在胃癌MCAs中的表达水平明显高于单层培养贴壁胃癌细胞。抑制c-Src表达,胃癌MCAs促凋亡蛋白caspase-3表达明显上调,抗凋亡蛋白bcl-2表达明显下调,胃癌MCAs凋亡率明显上升。本研究首次证实Src蛋白在胃癌MCAs抗“失巢凋亡”中发挥重要作用。