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目的：截短克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌Hly基因抗原优势区域，构建重组表达载体，实现原核高效表达，进而研究表达蛋白的抗原性，为研究其致病机制及溶血素抗原蛋白的研发提供实验基础和理论依据。 方法：根据GenBank公布的牛源无乳链球菌[CP018623.1]溶血素基因序列设计与合成引物，以牛乳源性无乳链球菌1886菌株基因组DNA为模板，利用PCR技术获得hly溶血素基因片段，经转入到原核表达载体pET-30a（+）中，构建重组质粒pET-30a-Hly，测序正确后，将其转化到E.coli/BL21（DE3）中，经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE电泳，Bandscan软件分析表达蛋白图谱，利用Western-blot试验验证重组蛋白的反应原性。利用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白，经鲜血琼脂培养基检测是否具有溶血活性，在经水溶性501佐剂乳化后免疫昆明小白鼠，探索其免疫原性，并建立检测免疫抗体滴度的间接ELISA。 结果：经测序和酶切结果表明，成功克隆了奶牛乳腺炎无乳链球菌1886菌株Hly溶血素基因，并成功构建了原核表达重组质粒，实现原核高效表达，表达主要形式以包涵体沉淀，重组蛋白分子量约为30Ku，蛋白复性后经纯化，蛋白含量达到1.2 mg/mL。Western-blot结果表明，重组蛋白具有良好的反应原性，间接ELISA检测免疫抗体滴度结果表明，表达蛋白具有良好的免疫原性，间接ELISA可检测到最低效价达1:25600。 结论：经Western-blot分析与间接ELISA检测,结果表明内蒙古地区临床分离无乳链球菌1886野生菌株溶血素Hly基因，抗原表位优势序列编码的多肽具有抗原性，可以作为候选免疫抗原，为研究其致病机制及新型疫苗奠定良好的实验基础。