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猪圆环病毒2型是世界上公认的对养猪业造成严重危害的致病菌之一,可与多种其他病原体混合感染,引起仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征和增生和坏死性肺炎等多种疾病,对各国养猪业造成巨大的影响。猪圆环病毒3型是一种2016年在美国发现的新型病毒,之后在世界各养猪国均有PCV3感染的报道,对未来养猪业会造成不容小觑的影响。猪圆环病毒2型和3型同属于猪圆环病毒,引起的疾病临床表现类似,在我国7个省市均有混合感染的报道,在湖南、湖北和江苏等地,二者混合感染率可达42.9%。目前已建立PCV2和PC V3的免疫学诊断方法和分子生物学诊断方法,其中包括常见的酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、聚合酶链式反应(Polym erase Chain Reaction,PCR)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PC R,q PCR)等检测方法。这些检测方法大多存在耗时长、灵敏度低、易污染等缺点。本实验旨在利用微滴式数字PCR技术(Droplet Digital PCR,dd PCR)建立一种快速、高效、可同时对PCV2和PCV3定量的检测的方法,可对猪的病料组织或者血清等低浓度样本进行特异性定量检测。具体研究内容如下。1.单重PCV2微滴式数字PCR检测方法的建立,单重PCV3微滴式数字PCR检测方法的建立。选择PCV2和PCV3中目的基因的保守序列片段(Gen Bank No.KC823059.1和KY778776)与载体p UC59合成质粒,并利用Primer Premier 5软件设计引物。通过引物筛选、优化退火温度和引物探针浓度比建立PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法,通过特异性实验探究建立的反应体系的特异性,并比较了所建立的PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法与PCV2和PCV3实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度和重复性。实验结果表明,当引物探针浓度比为400 n Mv:200 n M和退火温度为56℃时,阳性液滴集中,扩增效果最好,对其他核酸样本无特异性扩增,灵敏度均能达到0.1 fg/μL,dd PCR最低可检出1.1 copies/μL的p UC59-PCV2和1.03 copies/μL的p UC59-PCV3。其中PCV2的q PCR和dd PCR标准曲线相关系数(R~2)分别为0.9941和0.9762,dd PCR的扩增效率为83.41%;PCV3的q PCR和dd PCR标准曲线相关系数(R~2)分别为0.965和0.9575,dd PCR的扩增效率为80.75%。PCV2微滴式数字PCR检测方法与PCV2实时荧光定量PCR检测方法的组内组间实验CV(%)值均小于5,PCV3微滴式数字PCR检测方法与PCV3实时荧光定量PCR检测方法的组内组间CV(%)值均小于6.06,说明本实验所建立的四种检测方法其可重复性好,稳定性强。2.双重PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法的建立。让每个微反应体系都含有两套引物探针,分别用含有FAM和VIC两种不同的报告基团探针进行检测,实现PCV2和PCV3能同时高效的准确定量,提高检测效率,降低检测成本。本实验建立的双重PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法和的双重PCV2和PCV3实时荧光定量PCR检测方法灵敏度均能达到0.1 fg/μL,其中双重dd PCR检测检出0.1 fg/μL的p UC59-PCV2和p UC59-PCV3的拷贝数为1.1 copies/μL和1.32 copies/μL,双重q PCR检测PCV2和PCV3标准曲线相关系数(R~2)分别为0.9907和0.9682,双重dd PCR检测PCV2和PCV3标准曲线相关系数(R~2)分别为0.9651和0.9638,扩增效率分别为83.9%和78.8%。方差分析结果表明四个F值均小于其F crit值,则F值在a=0.05的水平上不显著差异。说明本实验建立的双重微滴式数字PCR和双重实时荧光定量PCR与单重检测之间结果无显著差异,且均呈现良好的线性关系。3.实际样本检测和试剂盒研发。利用已建立的q PCR和dd PCR两种检测方法对95份疑似感染PCV2的病猪样本进行检测,其中q PCR的阳性检出率为60%(57/95),dd PCR的检出率为62.10%(59/95),两种方法检测结果的kappa系数为0.9766,说明两种方法具有很好的一致性。其中dd PCR对q PCR检测出的疑似结果,能够通过具体拷贝数做出阳性或阴性的判断,在低浓度的检测样本中发挥出独特优势。本章实验也研发了两种双重检测试剂盒,其中试剂盒具有良好的特异性和灵敏度,能满足各种环境和条件下的检测要求,且节约了成本,缩短了检测时间,在一次反应过程种能对PCV2和PCV3同时检出,将会有广阔的市场前景。