【摘 要】
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动物基因组定向编辑技术是通过CRISPR-Cas系统在靶位点高效引入DNA双链断裂,利用同源定向修复（homology-directed repair,HDR）实现基因敲入,具有较大的科研和应用价值。CRISPR-Cas系统作为基因编辑领域具有潜在革命性的新工具,能对基因组实现高效的定点编辑。Cas9系统是Cas家族目前使用最广泛的,而Cas12a（Cpf1）在发现后同样被迅速投入到实际应用中,两
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动物基因组定向编辑技术是通过CRISPR-Cas系统在靶位点高效引入DNA双链断裂,利用同源定向修复（homology-directed repair,HDR）实现基因敲入,具有较大的科研和应用价值。CRISPR-Cas系统作为基因编辑领域具有潜在革命性的新工具,能对基因组实现高效的定点编辑。Cas9系统是Cas家族目前使用最广泛的,而Cas12a（Cpf1）在发现后同样被迅速投入到实际应用中,两种系统分别擅长对CG含量丰富DNA和AT含量丰富DNA进行编辑。基因编辑猪在医学农业领域具有多种用途,但由于HDR效率的低下,使得构建转基因修饰细胞系和修饰动物的工作十分低效且耗时巨大,为提高猪基因组HDR效率,本研究以猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFF）和猪肾细胞（porcine kidney cells,PK-15）为研究对象,利用共济失调毛细血管扩张症Rad3相关蛋白（ataxia-telangiectasia mutated-and Rad3-related,ATR）抑制剂VE-822和BAY-1895344处理细胞,通过CRISPR-Cas9/Cpf1不同修复方式的荧光报告载体研究其对HDR效率的影响及作用分子机理。主要研究结果如下:（1）构建了基于CRISPR-Cpf1和Cas9的HDR-GFP报告载体,可以快速检测HDR效率,便于筛选有效促进HDR效率的小分子化合物。（2）在PFF和PK-15细胞中转染CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1系统,通过HR、HMEJ、MMEJ修复将EGFP荧光报告基因整合至猪β-actin和GAPDH基因组上,多重验证后筛选出ATR抑制剂VE-822和BAY-1895344,联合作用于猪细胞能显著提高不同CRISPR-Cas系统HDR效率0.2～3倍,且没有发现对细胞的毒害作用,表明可用于促进细胞中精确遗传修饰效率,建立精确修饰基因猪模型。通过比较发现,VE-822和BAY-1895344对Cpf1蛋白促进效果略微优于Cas9蛋白,同时对PFF细胞的促进效果也优于PK-15细胞,表明这两种ATR抑制剂在促进HDR效率上受多种因素影响。（3）通过细胞周期和实时荧光定量检测,发现VE-822和BAY-1895344处理PFF细胞后,G1期数量减少,S和G2期数量增加;ATR、Rad51和DNA-PK基因表达量显著上调;初步鉴定提高HDR效率并不是由于抑制NHEJ,潜在作用机理与细胞周期阻滞,ATR、Rad51、DNA-PK表达量相关。
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