目的:建立胃癌荷瘤裸鼠模型,观察绿茶提取物EGCG对荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况的影响,观察EGCG对荷瘤裸鼠肿瘤组织SMO/Gli-1信号通路及凋亡相关因子表达的影响;体外培养人胃癌细胞MGC-803,观察EGCG对胃癌细胞超微结果的影响及凋亡形态学改变,研究EGCG对凋亡相关因子表达的影响与SMO/Gli-1信号通路的关系。通过体内体外研究,探讨EGCG是否具有抑制胃癌的作用及其具体的作用机制,为EGCG治疗胃恶性肿瘤提供新思路,为临床应用中医药治疗肿瘤及进一步相关研究提供实验依据和科学支持。材料与方法:论文一:选用人胃癌细胞株MGC-803,行裸鼠腋窝处皮下注射,制备荷瘤鼠模型。接种肿瘤细胞8日后,取建模成功的裸鼠,称重并记录,随机分成四组:对照组,每日腹腔内注射三蒸水;EGCG低浓度组,每日腹腔内注射10mg/kg的EGCG;EGCG高浓度组,每日腹腔内注射20mg/kg的EGCG;5-FU组,隔日一次肿瘤旁注射5-FU(剂量为50mg/kg)。5-FU组为阳性对照组,EGCG组为实验药物组,给药时间均为2周。给药期间每日观察各组裸鼠进食、饮水、精神状况及活动情况;隔日测量裸鼠体表肿块的长径(A)和短径(B)并记录数据,观察肿瘤生长情况和大小,依据公式计算肿瘤体积(V=1/2×A2×B);给药前和给药结束后测量各组裸鼠体重。给药结束后处死荷瘤裸鼠,取出皮下肿瘤称量,依据如下公式计算EGCG对胃癌的抑瘤率,抑瘤率=(对照组的肿瘤重量-实验组的肿瘤重量)/对照组肿瘤重量×100%;将裸鼠的肿瘤进行进一步处理,进行HE染色分析,观察不同组裸鼠肿块胃癌细胞改变情况。论文二:取论文一的肿瘤组织标本进行进一步实验,研究EGCG抑制胃癌的具体机制,探讨EGCG对Shh通路的作用情况及其与凋亡指标之间的关系。首先,在透射电镜下观察不同组肿瘤组织切片中胃癌细胞的超微结构的改变情况,有无凋亡的特征性改变及组间差异;第二,肿瘤组织切片行免疫组化染色,观测凋亡相关指标(bcl-2,bax和caspase-3)在各组间的分布情况,依据其染色的深浅及密度判断各个指标表达水平的变化;第三,采用RT-PCR方法检测各组肿瘤组织中的SMO,Gli-1,bcl-2,bax及caspase-3因子的mRNA表达情况,并比较各组间有无显著性差异;第四,应用Western blotting方法,检测各组肿瘤组织中的SMO,Gli-1,bcl-2,bax及cleaved caspase-3蛋白表达情况。论文三:体外培养人胃癌细胞MGC-803,探讨EGCG抑制胃癌细胞生长、促进凋亡的作用机制。首先,应用MTT法测定不同浓度的EGCG抑制肿瘤细胞存活的效果,依据OD值筛选出最佳的药物浓度。将培养的人胃癌细胞MGC-803分为四组:(1)空白对照组:人胃癌细胞MGC-803细胞培养后不加任何药物;(2)EGCG组:加入的EGCG浓度为20mmol/L,药物作用时间为24h;(3)Gli-1转染组:进行Gli-1质粒转染使Gli-1过表达;(4)Gli-1转染+EGCG组:进行Gli-1质粒转染使Gli-1过表达后,再加入20mmol/L的EGCG,并作用24h。应用TUNEL染色法观察各组细胞的凋亡程度;应用流式细胞仪检测各组细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI染色法检测各组胃癌细胞的凋亡情况及早期凋亡和晚期凋亡的比率;利用RT-PCR和Western blotting技术,测定各组胃癌细胞的SMO,Gli-1,bcl-2,bax和caspase-3的mRNA及蛋白表达情况,观察EGCG对胃癌细胞SMO/Gli-1通路的影响。通过Gli-1转染使胃癌细胞的Gli-1过表达,验证EGCG对凋亡相关指标的影响是否通过抑制SMO/Gli-1而发作作用的。结果:论文一1.药物干预对荷瘤裸鼠一般状况的影响裸鼠皮下接种人胃癌MGC-803细胞后局部皮肤未见明显红肿及皮肤破溃等不良反应,肿块逐渐增长,接种8天后,肿块直径达0.8cm,成瘤效果良好。人胃癌细胞MGC-803荷瘤裸鼠建模成功后,随机分成4组,各组小鼠体重无明显差异,然后给予不同的药物干预。对照组及不同浓度的EGCG组裸鼠无厌食、不安、腹泻等不良情况,个体间交流及活动基本正常;而5-FU组裸鼠用药后精神状况差,少食、易激、偶有腹泻,个体间少有交流,活动范围缩小,每日进食及活动范围均较其他组明显减少,应用药物2周后裸鼠体重平均值较其他组明显减低(19.30±1.54g),差异具有显著性(P<0.05)。整个实验过程无小鼠死亡情况发生。2.药物干预对荷瘤裸鼠体重的影响给药前各组裸鼠体重无明显差异,重量基本在18.6g左右。药物干预2周后(A)再次称量裸鼠重量,对照组裸鼠平均重量为21.13±1.43g,EGCG低浓度组裸鼠平均重量为21.73±1.05g,EGCG高浓度组裸鼠平均重量为21.85±1.52g,这三组之间裸鼠给药后的体重均无统计学差异(P>0.05),而5-FU组裸鼠平均重量为19.3±1.54g,明显低于其他各组,与其他任一组相比,均有统计学差异(P<0.05)。3.药物干预对于肿瘤体积的影响用药2周后处死裸鼠,称量体重后完整切除腋下肿块并称重,依据公式计算抑瘤率。随着时间的延长,各组裸鼠的肿瘤体积均逐渐增大,同一时间点,与对照组相比,EGCG低浓度组、EGCG高浓度组及5-FU组的肿瘤体积增大幅度明显减小。自给药第3天起,5-FU组肿瘤体积小于对照组与EGCG低浓度组,且具有显著性差异(P<0.05)。EGCG高浓度组自给药第3天起,肿瘤体积显著小于对照组,差异具有显著性(P<0.05),给药第7天起,EGCG高浓度组的肿瘤体积显著低于EGCG低浓度组,差异具有显著性(P<0.05)。自第5天起EGCG低浓度给药组肿瘤体积显著小于对照组(P<0.05)。给药结束后,对照组肿瘤体积为1921±183mm~3,EGCG低浓度组肿瘤体积为1174±294 mm~3,EGCG高浓度组肿瘤体积为730±125mm~3,5-FU组肿瘤体积为679±202mm~3。EGCG高浓度组及5-FU组相比,虽然前者肿瘤体积数值略大,但无统计学差异。4.药物干预对于肿瘤重量的影响及抑瘤率的比较各组肿瘤称取重量并记录,计算平均值,对照组为1.13±0.09g,EGCG低浓度组为0.89±0.13g,EGCG高浓度组为0.58±0.06g,5-FU组为0.52±0.07g。不同浓度的EGCG组以及5-FU组的肿瘤重量均显著低于对照组(P<0.05);EGCG高浓度组和5-FU组相比无统计学差异(P>0.05);与EGCG低浓度组比较,EGCG高浓度组和5-FU组的肿瘤重量明显降低,具有显著性差异(P<0.05)。根据各组肿瘤重量计算的平均值,按照上述公式进行计算各组药物的抑瘤率,量化抑瘤率以进行组间的比较。以对照组的抑瘤率作为基准,为0%。EGCG低浓度组为21.24%,抑瘤率良好;EGCG高浓度组抑瘤率为48.67%,明显高于低浓度组;阳性对照组5-FU组的抑瘤率最高,达到了53.98%,略高于高浓度EGCG组。5.HE染色观察各组肿瘤组织细胞形态变化各组肿瘤组织HE染色后,显微镜下发现,对照组结构清晰,胃癌细胞生长状态良好,细胞密度最大;不同浓度的EGCG组及5-FU组肿瘤细胞呈现形态变小、变圆状态,细胞间距改变明显,出现细胞核浓缩表现。随着EGCG浓度的增加,上述表现更为明显,5-FU组的形态改变最为明显。论文二1.透射电镜下观察各组肿瘤组织的细胞超微结构变化电镜下发现,对照组的胃癌细胞形态正常,EGCG低浓度组中胃癌细胞出现核内异染色质增多和边集,细胞体积开始浓缩、变圆等变化;EGCG高浓度组,细胞体积开始明显缩小,固缩核呈现不均一的块状结构,和周围间隙增大,呈现空泡状,开始出现发芽和起泡处胞膜的凋亡小体;5-FU组,细胞核破裂,降解,消化和形成空泡和电子密度高的物质,凋亡小体明显增多。2.免疫组化染色观察各组肿瘤组织的胃癌细胞凋亡情况各组肿瘤组织的免疫组化结果显示,与对照组比,EGCG组及5-FU组可明显降低凋亡基因bcl-2的表达,增加促凋亡基因bax及caspase-3的表达,EGCG高浓度组比EGCG低浓度组作用更加明显,具有一定的剂量-效应关系。而5-FU组与EGCG高浓度组比较,作用效果无显著差异。3.RT-PCR检测Shh信号通路中SMO,Gli-1和凋亡相关指标bcl-2,bax,caspase-3的mRNA表达情况RT-PCR结果显示,EGCG可以降低荷瘤裸鼠肿瘤组织中SMO,Gli-1及bcl-2的mRNA表达量,增加促凋亡基因bax及caspase-3的mRNA表达,并且随着EGCG浓度的增加其作用更加明显(P<0.05)。5-FU组与EGCG高浓度组效果相当,两组间各指标均无统计学差异。4.Western blotting RT-PCR检测Shh信号通路中SMO,Gli-1和凋亡相关指标bcl-2,bax,cleaved caspase-3的蛋白表达情况Western blotting结果显示,EGCG可以降低荷瘤裸鼠肿瘤组织中SMO,Gli-1及bcl-2的蛋白表达,增加bax及cleaved caspase-3的蛋白表达,且随着EGCG浓度的增加其作用更加明显,组间具有显著差异(P<0.05)。5-FU组与高浓度EGCG组效果相当,两组间各指标均无统计学差异。论文三1.MTT实验筛选EGCG实验浓度取0、10、20、40mmol/L浓度的EGCG行MTT实验观察胃癌细胞存活情况,随药物浓度的增加及作用时间的延长,胃癌细胞的存活率(OD值)逐步下降;20及40mmol/L的EGCG在作用24h时OD值分别为0.50±0.07和0.45±0.06;作用48h的OD值分别为0.45±0.06和0.35±0.06,均无显著性差异(P>0.05),结合等效低剂量原则,选用20mmol/L的EGCG作为体外实验药物浓度;2.Gli-1质粒转染使人胃癌细胞的Gli-1过表达设定空白对照组、阴性转染组及Gli-1转染组,转染后行Western blotting检测各组胃癌细胞Gli-1蛋白表达水平来评估转染效率,阴性转染组与对照组Gli-1蛋白表达无显著差异(P>0.05),证明转染试剂对蛋白表达无影响;而Gli-1转染组胃癌细胞的Gli-1蛋白表达水平显著上调(大于2倍),证实了Gli-1转染成功。3.TUNEL染色实验结果显示,对照组的胃癌细胞可见少量双标定位绿色凋亡细胞,而与对照组比较,Gli-1转染组标记凋亡细胞数略有减少,EGCG组双标定位的凋亡细胞明显增多。转染后再加入EGCG组凋亡细胞数明显多于单纯转染组,但显著少于EGCG组,说明了转染Gli-1质粒后可抑制EGCG的促胃癌细胞凋亡作用。4.流式细胞技术观察细胞周期改变流式结果显示:与对照组相比,EGCG组凋亡细胞明显增多,细胞DNA复制期(S期)细胞数有所减少,而Gli-1转染组凋亡细胞较对照组有所减少,G1期略有减少,但S期明显增多;转染后加入EGCG组的凋亡细胞比例再次增加,仍少于EGCG组,S期细胞数有所增加。提示转染Gli-1质粒后可抑制EGCG的促胃癌细胞凋亡及阻滞细胞周期作用。5.Annexin V-FITC/PI染色Annexin V-FITC/PI结果表明,在对照组内,早期凋亡的(Annexin V+,PI-)的细胞比例为10.4%,晚期凋亡的(Annexin V+,PI+)细胞比例为5.6%;在EGCG组中,早期凋亡的细胞比例增加至45.0%,晚期凋亡细胞增加至16.7%,EGCG可明显诱发人胃癌细胞MGC-803发生凋亡,同时发生坏死的细胞数也稍有增加;与对照组比较,转染Gli-1质粒后,早、晚期凋亡细胞数均有所下降,说明了Gli-1高表达可抑制胃癌细胞发生凋亡;而转染Gli-1质粒后再加入EGCG组可以再次诱导细胞凋亡增加,其中早期凋亡比例为37.2%,晚期凋亡比例为9.6%,总凋亡数为46.8%,较EGCG组明显减少,提示EGCG促进胃癌细胞凋亡的作用与Gli-1有关。6.RT-PCR分析mRNA表达量RT-PCR结果显示,与对照组相比较,EGCG组可明显增加bax及caspase-3的mRNA表达量,降低SMO,Gli-1及bcl-2的mRNA表达量(P<0.05);而Gli-1转染后再加入EGCG干预组,EGCG增加bax和caspase-3的mRNA表达的作用明显弱于EGCG组(P<0.05),EGCG降低Gli-1及bcl-2的mRNA表达的作用也明显弱于EGCG组,说明EGCG促凋亡作用与Gli-1有关。7.Western blotting分析蛋白表达量Western blotting结果显示,与对照组相比较,EGCG组可明显增加bax及cleaved-caspase-3的蛋白表达水平,降低SMO,Gli-1及bcl-2的蛋白表达水平(P<0.05);而Gli-1转染后再加入EGCG干预组,EGCG增加bax和cleaved caspase-3的蛋白表达的作用明显弱于EGCG组(P<0.05),EGCG降低Gli-1及bcl-2的蛋白表达的作用也明显弱于EGCG组,说明EGCG促凋亡作用与Gli-1有关。该结果与RT-PCR结果趋势一致,说明了EGCG通过改变Shh通路蛋白的表达,促进胃癌细胞凋亡。结论:1.EGCG能抑制人胃癌细胞荷瘤裸鼠的肿瘤生长,该抑制作用呈现一定的剂量-效应关系。EGCG高浓度组(20mg/kg)的抑瘤效果与5-FU组效果相当,但EGCG具有低副作用的优点。2.EGCG可以通过SMO/Gli-1通路阻滞细胞分裂,使部分人胃癌MGC-803细胞阻滞于G1期,减少进入S期(增殖期)细胞数,从而抑制细胞增殖。3.EGCG可以通过抑制SMO/Gli-1通路,上调促凋亡基因bax及caspase-3表达,下调抑凋亡基因bcl-2,从而诱导人胃癌细胞MGC-803发生凋亡。