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研究目的在全世界的人群中,有超过80%的人在一生中会经历某种形式的腰痛,其中椎间盘退化(intervertebral disc degeneration,IDD)是导致各种形式腰痛的常见原因之一。造成IDD的主要原因是遗传因素,研究影响IDD发生的遗传因素具有非常重要的意义。基因组研究揭示了大量与IDD发生密切相关的基因多态性,如编码胶原蛋白、蛋白聚糖、白介素(interleukins,ILs)、凋亡因子、维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)、MMPs等蛋白的基因多态性。随着我们对与IDD相关的基因多态性的深入研究和理解,我们将能够对患IDD的患者进行个性化护理和个体化治疗。因此,发现与IDD易感性相关的基因多态性具有重要的临床应用价值。凝血栓蛋白(Thrombospondins,THBSs),又叫凝血酶敏感蛋白、血小板反应素等,是一组与胶原蛋白和组织结合的糖蛋白,在组织发育和修复过程中参与细胞与细胞及细胞与基质之间的相互作用。本课题主要研究的THBS2基因和THBS1基因是THBSs家族中结构和功能上有相似之处的两个基因。有文章通过生物信息学方法对比分析正常椎间盘的髓核组织与IDD患者椎间盘髓核组织中基因表达的差异,发现THBS1在退变的椎间盘髓核中表达下降,可能在IDD的发病中有一定作用。THBS2基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点也被报道与腰椎间盘突出、腰椎管狭窄等疾病的发生发展密切相关。综上,本课题拟解决的主要问题是在中国北方汉族人群中,THBS1基因和THBS2基因的基因多态性是否与IDD发病相关,而这两个基因的SNP突变位点又是否能作为潜在的IDD发病相关的重要分子标志物。综合文献报道的结果及HapMap数据库(人类基因组中常见遗传多态位点目录)中的SNP位点信息,我们选择了 THBS2基因的rs6422747和rs6422748位点以及THBS1基因的rs2228262和rs2292305位点作为本课题的主要研究对象。研究方法按照制定的病例组及对照组的纳入标准和排除标准,本课题的主要研究对象为于2015年7月至2016年7月间就诊于山东大学齐鲁医院(青岛)并确诊为IDD的患者和健康管理中心参加体检的健康人。IDD的确诊根据MRI扫描结果判定,MRI扫描使用荷兰PHILIPS公司Achieval.5T磁共振机,扫描时为脊柱协同线圈,T2加权成像时回波时间(Echo time,TE)为120 ms,重复时间(Repetition time,TR)为 3500 ms,层厚/层距为 4.0/0.4 mm。IDD 椎间盘退变情况及程度根据MRIT2加权像中椎间盘的信号强度变化进行判断,具体分级标准参照Schneiderman 4级法评分标准,每个患者的MRI分级均由1名骨科医师及1名放射科医师共同评定。抽取病例组及对照组所有受试者静脉全血,并提取血液基因组DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)获得SNP位点所在的DNA片段,然后分别采用DNA测序和限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分型技术等方法,获得SNP位点的等位基因和基因型信息,分析等位基因/基因型与IDD临床表型之间的相关性。结果本研究病例组共纳入138名IDD患者,其中71名为女性,占51.45%,67名为男性,占48.55%,病例组平均年龄为47.6±12.3岁,平均BMI为22.5±2.7 kg/m2。病例组中,93名患者(67..39%)患腰椎间盘突出,45名患者(32.61%)患腰椎管狭窄。对照组由136名健康志愿者构成,其中66名为女性,占48.53%,70名为男性,占41.47%,对照组平均年龄为43.6±15.3岁,平均BMI为22.5±3.5 kg/m2。首先,采用DNA测序的方法检测THBS2基因的rs6422747和rs6422748位点。测序结果显示,rs6422747位点在病例组和对照组中均检测到A/G基因位点多态性,AA、AG、GG三种基因型均存在。rs6422748位点在病例组和对照组中也均检测到C/G基因位点多态性,CC、CG、GG三种基因型均存在。病例组及对照组研究对象的2个SNP位点基因频率分布情况均符合哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)。THBS2基因的rs6422747位点与IDD易感性的相关性分析结果显示,病例组与对照组之间,等位基因A与等位基因G的频率分布存在显著差异(p=0.009),存在等位基因的G的人群相较于存在等位基因A的人群更容易患IDD(OR=1.261,95%CI:1.055～1.506)。基于基因型分析的结果与等位基因分析结果类似,病例组中AG基因型和GG基因型的比例显著高于AA基因型,说明AG和GG基因型的人群相较于AA基因型人群来说,IDD易感性更高。因此,对rs6422747位点来说,等位基因G可能是IDD患病的危险因素。rs6422748位点的分析结果与rs6422747位点相似,病例组与对照组之间,等位基因C与等位基因G的频率分布存在显著差异(p=0.012),存在等位基因的G的人群相较于存在等位基因A的人群,IDD易感性更高(OR=1.250,95%CI:1.047～1.493)。病例组中CG基因型和GG基因型的比例显著高于CC基因型,说明CG和GG基因型的人群相较于CC基因型人群来说更易患IDD。因此,对rs6422748位点来说,等位基因G也是IDD患病的危险因素。2个SNP位点的基因型频率分布均与IDD严重程度无关。THBS1基因的rs2228262和rs2292305位点的检测采用PCR-RFLP方法。实验结果显示,所有病例组及对照组的研究对象中,rs2228262位点仅检测到AA一种基因型,AG、GG基因型均未检出。rs2292305位点则检出AA、AG、GG三种基因型。因此,仅对rs2292305位点进行后续相关性分析。病例组及对照组研究对象的rs2292305位点基因频率分布情况符合HWE。病例组与对照组之间,等位基因A与等位基因G的频率分布无显著差异(p=0.629,OR=1.261,95%CI:1.055～1.506),各基因型之间的频率分布亦无统计学差异。因此,THBS1基因的rs2292305位点多态性与IDD易感性无关。基因型频率分布与IDD严重程度的相关性分析结果显示,该SNP位点的基因型频率分布与IDD严重程度亦无关。结论1、THBS2基因的rs6422747位点和rs6422748位点多态性与IDD易感性密切相关,可能是IDD患病的危险因素。2、THBS2基因的rs6422747位点和rs6422748位点多态性与IDD的严重程度无关。3、THBS1基因的rs2292305位点多态性与IDD易感性和严重程度均无关。意义1、揭示了中国北方汉族人群中THBS2基因的SNP位点(rs6422747、rs6422748)与IDD易感性的相关性。2、发现了新的可能预测IDD发病的监测指标。3、加深了对IDD患病机制的认识,为IDD患者的个体化治疗方案提供了新的研究方向。