论文部分内容阅读
SDF4（Stromal Cell Derived Factor 4）是位于内质网内腔上的一种钙结合蛋白,属于CREC家族,在调控细胞内钙离子稳态和货物分选中起到重要作用。最近研究表明SDF4在人类癌症的发生发展中起着关键的作用,并且具有多种生物学功能,例如:胞内钙稳态、细胞的增殖、内质网应激等。脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤,由中枢神经系统的胶质细胞癌变而来,约占全部颅内肿瘤的40%-50%,而其中约50%为恶性胶质母细胞瘤（GBM）。上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下向间充质细胞转化的现象,与癌症的侵袭与转移有着密切的关系。细胞内Ca2+信号调节多种下游信号通路,控制着体内各种生理和病理进程,包括增殖、代谢和基因转录,是决定细胞命运的主要信号系统,同时也是癌症发生发展的调控枢纽。钙库操纵的钙离子内流(Store Operated Ca2+Entry,SOCE),包括内质网对Ca2+变化的感应和钙通道的开放,是一个广泛的和进化保守的钙内流通路。胞质Ca2+在许多细胞生命活动和肿瘤的发生中起着重要的调节作用。在本文中,我们利用分子生物学、细胞生物学、分子病理学等技术,探究了SDF4在胶质母细胞瘤中的作用机制,阐释了SDF4调控胶质母细胞瘤增殖和侵袭的分子机制,主要研究结果有:（1）SDF4高表达与胶质母细胞瘤患者的不良预后相关。我们首先检测了3种胶质母细胞瘤细胞系（LN-229,U-87 MG,A172）与正常脑胶质细胞系SVGp12中SDF4表达。随后在线分析了R2临床数据平台中Tumor-Glioma-French-284数据库的预后数据。以上结果显示SDF4在胶质母细胞瘤中的表达显著高于正常脑组织,且SDF4的高表达与患者的不良预后相关。（2）SDF4调控胶质母细胞瘤细胞的增殖侵袭能力。我们利用慢病毒介导的sh RNA技术下调胶质母细胞瘤U-87 MG和LN-229两种细胞系中SDF4的表达。MTT实验表明干涉SDF4后可以显著抑制细胞的生长。Brd U实验结果显示SDF4表达下调后DNA复制的细胞阳性率减少。流式细胞仪周期分析显示SDF4表达下调后细胞周期进程被阻滞在S期。随后检测了S期相关蛋白的表达,结果显示CDK4,Cyclin D1和C-MYC表达明显减少。此外Transwell实验和划痕实验显示SDF4表达下调后细胞的迁移侵袭能力显著降低。Western blot实验检测到与迁移侵袭相关的蛋白（E-cadherin,β-catenin,Snail,MMP3,MMP9,Vimentin）表达均发生下调。以上结果表明SDF4对胶质母细胞瘤细胞的增殖和侵袭有重要作用。（3）SDF4通过调控NFAT1信号通路促进细胞的增殖和侵袭能力。我们在GBM细胞中过表达SDF4后,用NFAT1的去磷酸化抑制剂（FK-506）处理,MTT实验和Brd U实验显示细胞的增殖能力和DNA复制能力被抑制。Transwell实验和划痕实验显示细胞的侵袭能力也被明显抑制。同时Western blot实验检测到增殖侵袭相关蛋白（CDK4,Cyclin D1和MMP3,Snail1）表达也被显著抑制。最后,我们利用染色质免疫共沉淀技术（Ch IP）和双荧光素酶实验检测到NFAT1可以在MMP3启动子处富集并激活MMP3的转录表达。（4）SDF4通过减少β-catenin泛素化调控β-catenin信号通路。实时荧光定量PCR分析发现SDF4表达下调后并不影响β-catenin的m RNA水平。随后利用MG132处理LN-229细胞的干涉sh SDF4组和对照sh GFP组,Western blot实验结果显示加入MG132后β-catenin的降解被抑制。用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理LN-229细胞的过表达SDF4组和对照p CDH组,Western blot实验结果显示过表达SDF4后可降低β-catenin的降解速率。随后我们检测了β-catenin的泛素化水平,发现过表达SDF4后β-catenin的泛素化水平降低。（5）SDF4通过Ca2+-NFAT1信号通路影响β-catenin的泛素化。我们利用一些钙离子通道抑制剂和激活剂处理LN-229细胞,发现β-catenin泛素化水平受胞内钙离子水平的调节。随后我们在LN-229细胞中过表达SDF4并用FK-506处理,Western blot实验检测到FK-506可以抑制过表达SDF4细胞中β-catenin的表达。两种转录因子都受到胞内Ca2+的调节,且都受磷酸化水平的调控。我们通过免疫共沉淀实验发现NFAT1与β-catenin相互作用,且两者都和GSK3β存在相互作用。我们猜测SDF4调控的β-catenin的泛素化降解是通过Ca2+-NFAT1介导的。随后我们在MG132处理细胞后加入FK-506,结果显示FK-506诱导的β-catenin的泛素化降解被明显抑制。最后我们通过免疫荧光实验检测到,β-catenin与定位在细胞质中的p-NFAT1存在共定位。以上结果说明SDF4可以通过调节胞质内NFAT1的磷酸化水平来介导β-catenin的泛素化降解。总之,我们发现SDF4的高表达与胶质母细胞瘤患者的不良预后相关。首次报道SDF4引起细胞内Ca2+水平的改变可以激活Ca2+-NFAT1信号通路,细胞质内NFAT1的去磷酸化激活也可以调节β-catenin的泛素化降解,并诱导细胞增殖和迁移的变化。我们的研究结果表明SDF4诱导的Ca2+-NFAT/β-catenin轴的失调会促进胶质母细胞瘤细胞的增殖和侵袭能力。因此,我们的研究为钙信号通路作为新的胶质母细胞瘤的治疗靶标提供了理论基础和指导意义。