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目的牙周病、糖尿病、心血管疾病和正畸治疗等许多因素均可以导致人体局部组织的血液循环障碍。当牙周组织处于炎症状态下,局部微循环障碍,牙周组织乏氧明显。组织乏氧以及炎症细胞因子都可以活化核因子κb受体活化因子配基(receptor activator of NF-κ B ligand, RANKL),它能与位于破骨细胞表面唯-的受体-核因子-κB受体活化因子(receptor or activator of nuclear factor-κ B, RANK)相结合,通过一系列酶促级联反应引起破骨细胞的活化和成熟。骨保护素(osteoprogeterin, OPG)为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体超家族成员,属于一种溶性的糖蛋白,是RANKL的天然诱饲受体。OPG能竞争性地与RANKL结合,从而阻断RANK与RANKL间的相互作用,抑制破骨细胞的活化和成熟。牙周病是一类侵犯牙龈和牙周支持组织的慢性炎症性破坏性疾病,在乏氧微环境和局部炎症细胞因子的作用下,牙周组织周围环境和牙周组织细胞代谢发生改变。在全身因素和局部因素的调控下,成骨细胞和破骨细胞作用失衡,骨吸收大于骨丧失。本实验旨在体外乏氧环境下培养人牙周膜细胞,模拟相当于牙周膜组织局部缺氧的病理模型。探讨不同氧张力对牙周膜细胞RANKL/OPG系统表达的影响,运用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附法检测牙周膜细胞在乏氧和常氧环境下RANKL mRNA和OPG mRNA及蛋白的表达。研究乏氧对牙周膜细胞生物学特性的影响,为进一步研究乏氧对牙周病理变化及组织再生奠定理论基础。方法人牙周膜细胞取自11-18岁儿童因正畸原因拔除的健康前磨牙,牙根已发育完成,刮取其根中1/3牙周膜组织,常规组织块培养法培养。待细胞增殖达汇合点后行细胞传代,取第5-7代细胞用于实验。1.实验分组乏氧组：牙周膜细胞分四组在1%O2、5%CO2、94%N2的37℃培养箱中分别培养6h、12h、24h和48h。对照组(常氧组)：牙周膜细胞分四组在20%02、5%CO2、75%N2的37℃培养箱中分别培养6h、12h、24h和48h。2.将牙周膜细胞以密度为1×106个/ml接种于六孔板中,按上述实验分组分别移入培养箱中培养,Trizol两步法分别提取细胞总RNA,反转录为c DNA,实时荧光定量聚合酶链反应检测RANKL mRNA和OPG mRNA的表达情况。3.将牙周膜细胞以密度为1×106个/ml接种于六孔板中,按上述实验分组移入培养箱中培养12h、24h、48h,收集条件培养液,-80℃保存,酶联免疫吸附法检测OPG蛋白表达。结果1.乏氧组6h、12h、24h、48h组牙周膜细胞RANKL mRNA的表达明显高于对照组,乏氧6h组与对照组相比差别不具有统计学意义(P>0.05),乏氧12h、24h、48h组与对照组相比RANKL mRNA的表达升高,且有时间依赖性,差别具有统计学意义(P<0.05)。2.乏氧6h、12h、24h、48h组牙周膜细胞OPG mRNA的表达明显低于对照组,随乏氧时间延长,OPG mRNA的表达下降,差别具有统计学意义(P<0.05)。3.酶联免疫吸附试验检测乏氧条件下12h、24h、48h人牙周膜细胞培养液中OPG浓度明显低于对照组,随乏氧时间的延长OPG降低,差别具有统计学意义(P<0.05)。结论乏氧培养人牙周膜细胞RANKL mRNA表达升高,提示乏氧使牙周膜细胞RANKL表达增加,RANKL在牙周组织中蓄积,诱导破骨细胞形成；且OPGmRNA和蛋白的表达降低,提示乏氧时牙周膜细胞分泌的OPG减少,对前体破骨细胞分化成熟的抑制作用减弱。本实验提示牙周病使牙周组织周围环境发生改变,牙周组织乏氧,在细胞因子RANKL和OPG的作用下牙周膜细胞向破骨细胞分化,加重牙槽骨的吸收破坏,不利于牙周组织的修复和再生,进而加速牙周炎的发生和发展。