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心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)已成为威胁生命健康的首要关键因素。药物洗脱支架(drug eluting stent,DES)是目前临床上治疗狭窄类CVD最有效的手段。然而DES作为永久异物会增加支架内血栓发生的风险。鉴于此,基于可降解材料的生物可吸收支架(bioresorbable stent,BRS)应运而生。其中PLLA(poly-L-lactic acid)支架由于其良好的组织相容性和生物可降解性是第一个进入临床应用的BRS。但临床研究表明PLLA支架植入后晚期呈现严重并发症。因此,探究伴随PLLA支架降解过程血管狭窄发生的诱因将是未来优化聚乳酸类支架设计的关键。
乳酸(lactic acid,LA)是PLLA主要降解产物。同时LA也是细胞功能调节器,对于不同的细胞和组织能产生不同的生理或病理效应。PLLA降解过程中LA局部累积会刺激血管引起病理反应,暗示LA可能参与了导致PLLA支架内血管狭窄。由此,本文提出科学假设:“PLLA降解产生的LA可能是导致PLLA支架内血管狭窄的重要致病因素”。围绕此科学假设,本文研究主要得出以下五个结论:
1.PLLA支架引发较严重的血管再狭窄
在PLLA和316L不锈钢支架(bare metal stent,BMS)植入大白兔颈动脉的第3、6个月时,取支架段血管进行组织形态学分析。H&E(hematoxylin and eosin)染色显示PLLA支架组血管狭窄率远高于BMS组。Masson染色显示PLLA支架段血管纤维化程度明显加重。平滑肌细胞相关基因SM22α免疫组化染色显示其在PLLA支架段血管大量表达,尤其PLLA降解产物聚集的支架丝周围大量聚集表达SM22α,这可能暗示了PLLA降解产物在支架内血管狭窄发生中的作用。
2.PLLA降解产物LA刺激引发血管纤维化
将LA局部刺激大鼠腹主动脉血管进行实验。Masson染色显示LA刺激血管段纤维化明显加重;免疫组化染色显示纤维相关基因OPN的表达在LA处理组也明显更高;qPCR结果同样显示促纤维基因Collagen-1、Collagen-3、MMP2和MMP9的表达在LA处理组显著上调。这表明LA能诱导血管纤维化,这可能是PLLA支架内血管狭窄发生的原因。
3.LA诱导内皮间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)可能是血管纤维化发生的原因
多数证据表明EndMT是诱导血管纤维化的关键原因之一。LA刺激血管段表面染色(enface staining)显示血管内皮层内皮标记物vWF表达随时间逐渐降低,而间充质标记物SM22α则在内皮层与vWF共表达且随时间延长表达逐渐升高;切片染色显示内皮层大量表达SM22α,与vWF共表达的SM22α阳性细胞比例高达70%;免疫组化染色呈现了同样的趋势。这表明LA能在体内诱导EndMT。
选用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)来验证LA是否能在体外诱导EndMT。结果显示LA能够刺激HUVECs细胞形态变为长条状、下调内皮标记物和上调间充质标记物表达,刺激后的HUVECs基因表达谱趋向于TGF-β1处理组。同时也排除了LA导致pH降低对EndMT的影响。这表明在体外,LA也能诱导EndMT。
4.LA可能通过GPR81刺激TGF-β1信号介导EndMT
LA受体GPR81(G-protein-coupled receptor81)和TGF-β1信号相关蛋白在LA刺激下表达显著上调。抑制GPR81或TGF-β1表达联合LA刺激后显示内皮标记物和间充质标记物的表达无变化。这表明GPR81和TGF-β1信号参与介导了LA诱导EndMT。
TGF-β1和其转录因子Sp-1(specific protein-1)在LA刺激下被激活,而在敲低GPR81后表达却无变化。抑制Sp-1表达联合LA刺激后显示内皮标记物和间充质标记物的表达无变化。这表明Sp-1参与了调节LA激活TGF-β1,LA诱导EndMT的可能机制为LA刺激内皮细胞后GPR81首先被激活进而激活Sp-1,而Sp-1调节TGF-β1信号触发EndMT。
5.细胞力学变化可能是LA诱导EndMT的机制之一
LA能显著增强HUVECs的迁移能力和收缩能力,同时也能促进HUVECs骨架重排。而抑制骨架变化则能阻滞LA诱导EndMT。这表明细胞力学变化可能也参与了介导LA诱导EndMT。
综上,本文证实了LA在PLLA支架内血管狭窄发生中的作用,其机理可能是LA诱导EndMT导致血管纤维化。LA诱导EndMT的可能机制是LA通过GPR81刺激TGF-β1信号介导EndMT。本课题从PLLA降解产物LA累积角度探究了PLLA支架内血管狭窄发生的原因,为研究BRS植入后晚期呈现严重并发症的原因提供了一个新的角度,同时也为未来基于聚乳酸的BRS的优化设计与应用提供了新的理论依据。
乳酸(lactic acid,LA)是PLLA主要降解产物。同时LA也是细胞功能调节器,对于不同的细胞和组织能产生不同的生理或病理效应。PLLA降解过程中LA局部累积会刺激血管引起病理反应,暗示LA可能参与了导致PLLA支架内血管狭窄。由此,本文提出科学假设:“PLLA降解产生的LA可能是导致PLLA支架内血管狭窄的重要致病因素”。围绕此科学假设,本文研究主要得出以下五个结论:
1.PLLA支架引发较严重的血管再狭窄
在PLLA和316L不锈钢支架(bare metal stent,BMS)植入大白兔颈动脉的第3、6个月时,取支架段血管进行组织形态学分析。H&E(hematoxylin and eosin)染色显示PLLA支架组血管狭窄率远高于BMS组。Masson染色显示PLLA支架段血管纤维化程度明显加重。平滑肌细胞相关基因SM22α免疫组化染色显示其在PLLA支架段血管大量表达,尤其PLLA降解产物聚集的支架丝周围大量聚集表达SM22α,这可能暗示了PLLA降解产物在支架内血管狭窄发生中的作用。
2.PLLA降解产物LA刺激引发血管纤维化
将LA局部刺激大鼠腹主动脉血管进行实验。Masson染色显示LA刺激血管段纤维化明显加重;免疫组化染色显示纤维相关基因OPN的表达在LA处理组也明显更高;qPCR结果同样显示促纤维基因Collagen-1、Collagen-3、MMP2和MMP9的表达在LA处理组显著上调。这表明LA能诱导血管纤维化,这可能是PLLA支架内血管狭窄发生的原因。
3.LA诱导内皮间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)可能是血管纤维化发生的原因
多数证据表明EndMT是诱导血管纤维化的关键原因之一。LA刺激血管段表面染色(enface staining)显示血管内皮层内皮标记物vWF表达随时间逐渐降低,而间充质标记物SM22α则在内皮层与vWF共表达且随时间延长表达逐渐升高;切片染色显示内皮层大量表达SM22α,与vWF共表达的SM22α阳性细胞比例高达70%;免疫组化染色呈现了同样的趋势。这表明LA能在体内诱导EndMT。
选用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)来验证LA是否能在体外诱导EndMT。结果显示LA能够刺激HUVECs细胞形态变为长条状、下调内皮标记物和上调间充质标记物表达,刺激后的HUVECs基因表达谱趋向于TGF-β1处理组。同时也排除了LA导致pH降低对EndMT的影响。这表明在体外,LA也能诱导EndMT。
4.LA可能通过GPR81刺激TGF-β1信号介导EndMT
LA受体GPR81(G-protein-coupled receptor81)和TGF-β1信号相关蛋白在LA刺激下表达显著上调。抑制GPR81或TGF-β1表达联合LA刺激后显示内皮标记物和间充质标记物的表达无变化。这表明GPR81和TGF-β1信号参与介导了LA诱导EndMT。
TGF-β1和其转录因子Sp-1(specific protein-1)在LA刺激下被激活,而在敲低GPR81后表达却无变化。抑制Sp-1表达联合LA刺激后显示内皮标记物和间充质标记物的表达无变化。这表明Sp-1参与了调节LA激活TGF-β1,LA诱导EndMT的可能机制为LA刺激内皮细胞后GPR81首先被激活进而激活Sp-1,而Sp-1调节TGF-β1信号触发EndMT。
5.细胞力学变化可能是LA诱导EndMT的机制之一
LA能显著增强HUVECs的迁移能力和收缩能力,同时也能促进HUVECs骨架重排。而抑制骨架变化则能阻滞LA诱导EndMT。这表明细胞力学变化可能也参与了介导LA诱导EndMT。
综上,本文证实了LA在PLLA支架内血管狭窄发生中的作用,其机理可能是LA诱导EndMT导致血管纤维化。LA诱导EndMT的可能机制是LA通过GPR81刺激TGF-β1信号介导EndMT。本课题从PLLA降解产物LA累积角度探究了PLLA支架内血管狭窄发生的原因,为研究BRS植入后晚期呈现严重并发症的原因提供了一个新的角度,同时也为未来基于聚乳酸的BRS的优化设计与应用提供了新的理论依据。