背景与目的:已知大约20%的癌症患者迟早会出现脑转移,原发灶以肺癌、乳腺癌和黑色素瘤为主,共同的特征是脑转移被认为是通过循环肿瘤细胞播撒到大脑微血管中而发生的,在这个独特的微环境中,肿瘤的生长得到了促进(即更加恶性),目前尚无好的治疗方案来改善预后。脑转移癌的恶性进展仍然是晚期癌症患者致死的重要因素之一,因此人们对了解驱动脑转移的分子机制,以及脑转移相对于原发肿瘤的分子特征,从而为靶向治疗的选择提供信息充满了兴趣。基于蛋白质组学与既往的cDNA阵列不同,可直接从数以千计的蛋白质、而不是mRNA中,用互作网络图的形式达到可视化要求,并有办法从许多蛋白质中筛选到关键靶蛋白质,因此本文的目的筛选和优化摸拟转移、实际是人为(接种)生长在裸小鼠脑室内的人葡萄膜黑色瘤关键蛋白质,并用于靶向治疗研究。实验方法:(1)92.1细胞1X105于立体定向仪辅助下接种于绿色荧光裸小鼠右侧侧脑室,致瘤后解剖取肿瘤组织进行原代培养,把单克隆提纯的肿瘤细胞命名为92.1-A,并与亲本的92.1一起进行与增殖和恶性程度相关的细胞及分子生物学特性检测,观察其恶性表型。(2)将92.1和92.1-A两株细胞送杭州景杰生物科技有限公司建立蛋白质组学数据库(蛋白芯片),进尔用高通量分子生物信息学中的GO,KEGG和互作网络图的方法优筛92.1恶性进展成92.1-A的目标蛋白。(3)用Werstern Blot方法对目标蛋白在体外培养的92.1和92.1-A两株细胞中的表达进行验证后,分别用敲低、过表达的方法进行论证p62在葡萄膜黑色素瘤的恶性进展中起关键作用。结果与分析:(1)p62为重要研究目标:蛋白质组学分析结果表明,可把SQSTM1(p62)作为为目标蛋白质。p62又称自噬接头蛋白,对肿瘤组织中起双刃剑作用的自噬小体有着调控作用,为本文的重要研究对象。(2)92.1-A较92.1增殖能力更强:92.1-A根据CCK8方法绘制的细胞增殖曲线可以看出,长在96孔盘中,初始细胞2000个/孔/100μl培养基的92.1和92.1-A细胞的数量随着时间的推移,两株细胞的增殖曲线分离越来越明显,4-9d期间保持着显著性差异(4-9天的P值分别为0.0122,0.0155,0.0041,0.0391,0.0017,0.0164);取 92.1 和 92.1-A 对数生长期细胞 5×105个,流式细胞仪检测细胞周期,92.1-A的S期和G2-M期细胞所占的百分比明显高于92.1(p=0.001和p=0.0213),而G0-G1期细胞所占的百分比明显低于92.1(p<0.0001)。(3)4.92.1-A较92.1迁移及侵袭能力更强:用划痕愈合试验分析细胞迁移比例,92.1-A细胞愈合速率明显高于92.1,且有统计学差异(P<0.01);在Traswell,采用直接计数法对比两种细胞附着于聚碳酯膜下表面的细胞发现92.1-A多于92.1,且有统计学差异(P<0.01)。(4)设计 3 个 sgRNA 靶点,分别构建到载体pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro上,质粒敲低p62表达,肿瘤出现良性转化趋势:western blot显示在敲低链2(sip62#2)中p62表达明显下降(P<0.01),于是选择sip62#2用脂质体转染瘤细胞,结果表明对照组92.1-A增殖速率明显高于92.1-A-sip62#2 组;92.1-A-sip62#2 组的迁移(24h p=0.032,48h p=0.041)及侵袭能力较92.1-A也有明显降低(p=0.004),且有统计学意义。(5)选择p62表达较低的92.1为目标,使用慢病毒转染过表达其p62含量,western blot验证92.1-over-p62的p62表达量明显高于92.1组(P=0.017),CCK8检测92.1-over-p62生长速率明显高于92.1组;进一步检测其生物学特性发现92.1-over-P62的迁移(24h:p=0.003)及侵袭(p=0.0083)能力增强,结果有统计学意义。结论与讨论:(1)原位生长在眼眶内的葡萄膜黑色素瘤,人工接种在免疫缺陷裸小鼠脑室内,部份细胞在脑室脉络膜丛定植,其它细胞继续沿着脑脊髓液循环流动,最后在多处脑和软脑膜定植,虽然不能与其自发性脑广泛转移相提并论,但作为肿瘤种子细胞转移至脑以后的定植和随后的恶性进展,可以认为与自发转移相类似,因为其后续的恶性进展与自发转移一样,都是“种子与土壤”的关系,因此92.1-A和92.1可以分别代表转移灶和原发灶的肿瘤细胞用于蛋白组学的研究,建立的数据库可以用作黑色素瘤脑转移的分子机制研究。(2)有报告,在转移灶中发现了原发灶中未发现的CDKN2A和PIK3CA突变、PTEN缺失、ERJBB2扩增以及KRAS的激活,所有这些都对治疗有影响。本文报告的是SQSTM1(p62)在92.1-A(转移灶)的表达明显高于92.1(原发灶),可能具有不一样的生物学意义,但本文已经证明,用质粒敲低和慢病毒过表达p62,论证了 p62的表达与葡萄膜黑色素瘤恶性程度呈正相关,可能在肿瘤的恶性进展中起到关键作用。总上所述,我们首次提出:把p62作为治疗靶分子对以葡萄膜黑素瘤为代表的脑转移癌的原发灶和转移灶内的肿瘤细胞都有治疗作用,可为进一步向临床推广提供科学依据。