背景:肥胖已经成为目前全球最严峻的公共卫生问题之一,生活方式的调整——运动和饮食干预仍然是预防及管理肥胖的最优共识,尤其对于处于生长发育特殊阶段的肥胖儿童群体。通过运动增加能量消耗是公认最绿色健康的减肥方法,在快节奏的当今社会,研究既有效又高效的运动处方,对肥胖及其相关并发症的预防和治疗以及大众保健都具有重要意义。针对肥胖的运动干预中,高强度间歇运动（high intensity interval training,HIIT）和中等强度持续运动（moderate intensity continuous training,MICT）的争议一直存在,越来越多研究显示HIIT在减重及改善心肺适能、糖脂代谢等方面效果优于MICT,也有研究认为二者效果相似,甚至认为HIIT耐受性差或不安全。目前关于HIIT的作用机制多关注于心血管代谢及骨骼肌能量代谢,对肥胖及其并发症的全身及组织能量代谢干预效果及其机制研究还很少见。不健康饮食是另一关键的“致肥胖环境”,因此饮食干预同样至关重要。富含初榨橄榄油的地中海饮食对健康有诸多益处,被认为能降低冠心病发病率和死亡率、代谢综合征发病率等。羟基酪醇（hydroxytyrosol,HT）作为初榨橄榄油中的主要多酚类成分,是一种天然抗氧化剂,具有显著的抗炎、抗氧化应激作用。肥胖状态下营养负荷导致的细胞应激是驱动其他旁路信号进而导致慢性炎症、胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）、脂质代谢障碍等代谢并发症的病理生理基础,其中内质网功能障碍被认为是重要的整合因素。因此,内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERs）及其与代谢通路之间的广泛联系和交互作用可能为治疗肥胖相关的代谢障碍提供靶点,然而,目前尚未见关于HT对ERs及其下游炎症、胰岛素信号的作用及其机制研究。本实验旨在通过饮食诱导肥胖（diet-induced obesity,DIO）小鼠的运动及饮食干预实验,第一,研究两种不同的运动处方对青春期肥胖小鼠减重、脂质代谢、糖稳态及脂肪组织能量代谢的作用,并探讨潜在的机制;第二,研究HT干预对肥胖相关并发症IR、慢性炎症及肝脏脂质代谢障碍的影响,并结合体外实验探究ERs在其中发挥的重要作用。目的:1.通过运动干预后身体测量指标、组织水平分析、糖脂及能量代谢分子水平分析,对HIIT和MICT两种运动方式对肥胖小鼠的干预作用作一比较;并通过肝脏脂质代谢相关基因及其调节因子表达的检测,胰岛素敏感组织胰岛素信号、炎症信号通路的分析,棕色脂肪产热活性及白色脂肪组织棕色化的比较,揭示HIIT改善机体肥胖及糖脂质障碍的作用机制;2.通过HT干预后肥胖小鼠全身及组织炎症和IR改变,肝脏和脂肪组织的ERs水平变化以及肝脏脂质代谢改变,结合体外实验探究HT通过ERs作用于炎症通路、胰岛素信号转导通路和肝脏脂质代谢通路的信号级联。方法:1.DIO小鼠模型的建立:100只ICR小鼠给予高脂饮食（high fat diet,HFD）,另10只小鼠给予低脂饲料喂养。7周后,将HFD组中体重高于低脂饮食组平均体重20%的小鼠入选为DIO模型进行运动及饮食干预,运动干预分为静坐（SED）组、HIIT组、MICT组,饮食干预分为HFD组、HFD+HT组,各组10只并继续予HFD喂养,10只低脂饮食小鼠作为对照组（CON）继续予低脂饲料喂养;2.运动干预部分:（1）跑台:小鼠跑台机倾斜角度25°,HIIT组小鼠予10组×4min高强度(85⁹0%VO_2max)跑步训练,间歇期2 min（跑带速度5 m/min）;MICT小鼠跑步总距离与HIIT组相等,持续强度为65⁷0%VO_2max。每周训练5日（周一^周五）,干预8周,SED组不予任何处理;（2）定期称重,记录食水摄入量,处死后脂肪组织称重,计算体脂率;通过内脏白色脂肪组织（visceral white adipose tissue,vWAT）石蜡切片苏木素伊红（hematoxylin and eosin,H&E）染色,定量比较脂肪细胞体积;（3）全自动生化分析仪检测血脂指标:总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）,高密度脂蛋白胆固醇（high-density-lipoprotein cholesterol,HDL-c）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c）和肝功指标:丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）,全自动特种蛋白分析仪检测超敏C反应蛋白（high-sensitivity C reactive protein,hsCRP）水平,化学发光法检测血清中炎症因子（IL-6、脂联素）水平,ELISA法检测血清中胰岛素水平;（4）通过肝组织石蜡切片H&E染色观察肝脏组织学变化;组织提取液测定肝脏中TG含量;通过RT-qPCR检测脂质β-氧化相关酶（CPT-I、HAD）及其转录因子PPARα的基因表达,脂质合成调节酶（ACC、FAS、SCD-1）及转录因子SREBP-1c的基因表达;蛋白质免疫印记（Western blotting,WB）法检测PPARα及SREBP-1的蛋白表达;透射电镜分析肝脏细胞内线粒体数量、面积及形态;（5）通过糖耐量试验（glucose tolerance test,GTT）和胰岛素耐受试验（insulin tolerance test,ITT）评估全身葡萄糖耐量及胰岛素敏感性,通过空腹血糖、胰岛素水平计算HOMA-IR值;免疫荧光法（immunofluorescence,IF）检测vWAT中巨噬细胞浸润程度（F4/80+细胞数）;通过WB法检测vWAT中炎症通路（p-c-Jun/JNK1、IKKβ、TNFα、IL-1β）、胰岛素信号通路（ps-IRS-1/IRS-1、p-Akt/Akt、GLUT4）标记蛋白;（6）通过肩胛间棕色脂肪组织（interscapular brown adipose tissue,iBAT）大体形态及组织学免疫组化染色（UCP1）,比较BAT产热活性;通过对vWAT及腹股沟皮下白色脂肪组织（subcutaneous WAT,scWAT）免疫组化染色（UCP1）和棕色化标志蛋白（UCP1、PRDM16）检测,通过透射电镜观察scWAT线粒体数量及形态改变,分析运动后不同部位WAT的棕色化反应;3.饮食干预部分:（1）灌胃:HFD组予三蒸水（0.1 mL/kg bw）,HFD+HT组予HT（20 mg/kg bw）灌胃干预10周;（2）定期称重,记录食水摄入量,处死后各部位脂肪组织称重,计算体脂率;（3）定期测量空腹血糖,干预结束后行GTT、ITT;（4）生化分析仪检测血脂（TC、TG、HDLc、LDLc）、肝功（AST、ALT）水平,全自动特种蛋白分析仪检测hsCRP水平,化学发光法检测血清中炎症因子（IL-6、脂联素）水平,ELISA法检测血清中胰岛素水平;（5）WB法检测脂肪/肝脏组织中ERs通路（p-PERK/PERK、p-IRE-1α/IRE-1α、ATF6、GRP78）、炎症通路（p-c-Jun/JNK1、TNFα、IL-1β）及胰岛素信号转导通路（ps-IRS-1/IRS-1、p-Akt/Akt、GLUT4/2）的标志蛋白;IF法检测脂肪组织/肝脏中巨噬细胞浸润程度（F4/80+细胞数）;油红O染色检测肝脏脂滴沉积情况,磷酸甘油氧化酶法检测肝脏中TG含量;透射电镜分析肝脏ER形态;qRT-PCR及WB法检测肝脏脂质合成相关基因及蛋白的表达情况;（6）体外实验:通过棕榈酸（palmitate,PA）刺激HepG2细胞诱导ERs,予HT和ERs抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid,4-PBA）干预,验证HT对ERs及其下游通路的调节作用;并通过JNK抑制剂SP600125预处理,进一步说明HT部分通过IRE1α/JNK/IRS1通路改善胰岛素受体信号转导。4.统计学处理:计量资料数据采用均数±标准误（X±SEM）进行统计描述,采用单因素方差分析比较组间差异性,P≤0.05认为差异具有统计学意义。采用SPSS20.0软件进行数据处理分析。结果:运动干预部分1.运动组小鼠虽能量摄入高于SED组,但运动干预后体重明显低于SED组,且HIIT组小鼠体重显著低于MICT组,体重下降也较MICT组更显著（P=0.001）;运动组小鼠脂肪含量和体脂率明显低于SED组,且HIIT组低于MICT组（P分别为0.010,0.002）;MICT组内脏脂肪细胞体积较SED无明显改变,而HIIT组内脏脂肪细胞体积明显小于SED组和MICT组（P均为0.000）;2.运动组小鼠血清ALT和TG水平显著低于SED组,而只有HIIT组的TC和LDL-C水平明显低于SED组（P分别为0.000,0.002）;运动组肝脏组织空泡化脂滴明显减少,肝脏TG含量显著低于SED组,且HIIT组低于MICT组（P=0.045）;电镜分析显示运动组小鼠线粒体数目明显高于SED组,且HIIT组高于MICT组（P=0.000）,而只有HIIT组线粒体面积高于SED组（P=0.048）;HIIT组肝脏脂质氧化相关基因（PPARα、CPT1a、HAD）mRNA水平显著高于SED组,而MICT组与SED无差异,PPARα蛋白表达趋势与mRNA水平一致;运动组肝脏脂质合成转录因子SREBP1蛋白表达显著低于SED组,且HIIT组明显低于MICT组（P=0.013）;3.运动组空腹血糖、胰岛素水平、AUC_ITT、HOMA-IR明显低于SED组,且HIIT组均显著低于MICT组;HIIT组血清促炎因子IL-6和hsCRP水平均显著低于SED组和MICT组,抑炎因子脂联素水平高于MICT组（P=0.050）,运动组vWAT中F4/80+细胞数,TNFα、IL-1β蛋白表达量均明显低于SED组,且HIIT组vWAT中F4/80+细胞数、TNFα蛋白表达量显著低于MICT组,运动组p-JNK蛋白表达较SED组明显下调,但HIIT和MICT间无差异,运动组IKKβ蛋白表达较SED组无明显改变;运动组ps-IRS（Ser307）蛋白表达较SED组明显下调,p-Akt（Ser473）蛋白表达较SED组明显上调,且HIIT组调节作用较MICT组更显著;运动组GLUT4蛋白表达较SED组明显上调,且MICT组显著高于HIIT组;4.运动组iBAT大体标本的颜色较SED组加深,免疫组化显示单腔室脂滴较SED组增多,产热蛋白UCP1表达明显上调,且HIIT组较MICT组上调更显著（P=0.016）;只有HIIT组的scWAT出现了多腔室脂滴,脂滴面积较SED组明显减小（P=0.001）,棕色化蛋白UCP1、PRDM16的表达较SED组显著上调,线粒体数目显著高于SED组（P=0.000）和MICT组（P=0.017）。饮食干预部分1.相比三蒸水灌胃组,HT干预组小鼠空腹血糖、胰岛素水平,HOMA-IR值、AUC_GTT和AUC_ITT均显著下降;血清中炎症因子hsCRP、IL-6水平显著下降;肝脏和脂肪组织中ERs标志蛋白p-PERK、p-IRE、ATF6、GRP78表达均显著下降,炎症通路及胰岛素信号通路均有所改善,vWAT中巨噬细胞标记物F4/80表达显著减少;PA刺激HepG2细胞诱导ERs,HT预处理同样能显著下调ERs标记物及改善IRS1/Akt通路,且HT在100μM浓度时作用效果与ERs抑制剂4-PBA相仿;用SP600125抑制JNK后,HT对胰岛素受体通路的改善作用消失;2.相比三蒸水灌胃组,HT灌胃组小鼠体重、体脂含量、体脂率无明显改变,但肝脏组织脂滴沉积及TG含量明显减少,ER肿胀扩张明显缓解,肝脏脂质合成转录因子SREBP1c的mRNA及蛋白水平,其下游分子ACC、FAS、SCD1的mRNA水平均显著下调;PA刺激HepG2细胞诱导ERs,HT预处理同样能显著下调ERs标记物及SREBP1,且HT在100μM浓度时作用效果与ERs抑制剂4-PBA相仿。结论:运动干预部分1.HIIT在减轻体重、减少脂肪含量、减小内脏脂肪细胞体积方面更有优势;2.HIIT更有利于降低血脂及肝脏脂质沉积;机制:通过修复HFD引起的肝脏脂质代谢基因损伤和线粒体超微结构损伤;3.HIIT更有利于改善全身及脂肪组织糖稳态和慢性炎症状态;机制:通过改善胰岛素信号通路和炎症信号通路（JNK/IRS1）;4、HIIT更有利于增强iBAT的产热活性及诱导scWAT的棕色化。饮食干预部分1.HT能改善肥胖小鼠的全身慢性炎症、糖稳态及IR,改善胰岛素敏感组织的胰岛素受体通路及炎症通路;2.HT能通过缓解ERs改善胰岛素受体信号转导,部分由IRE1α/JNK/IRS1通路介导;3.HT能通过缓解ERs降低肝脏脂质合成通路相关基因和蛋白表达,从而改善肝脏脂质沉积。