研究背景:肝移植是终末期肝病的最有效治疗手段,但肝移植术后代谢并发症(如血脂异常、糖尿病等)发生率高,严重影响肝移植手术长期疗效。目前认为,免疫抑制剂的使用与供肝基因多态性是导致肝移植术后糖脂代谢紊乱的重要危险因素,但其潜在的分子机制尚不明确。本团队前期研究发现,mi R-33a在调控糖脂代谢稳态方面具有重要作用,但肝移植受者经历了缺血再灌注损伤、肝脏再生等作用后,肝脏微环境发生明显变化,此外免疫抑制剂的应用也会对mi R-33a的功能产生一定影响。在这些特殊背景下mi R-33a如何参与糖脂代谢稳态调控尚不清楚。因此,针对mi R-33a在维持肝移植术后受者糖脂代谢稳态中的作用及分子机制开展研究,将为肝移植术后代谢病的预警和治疗开辟新思路。研究目的:本研究拟从肝移植术后糖脂代谢紊乱这一临床问题出发,围绕免疫抑制剂的使用和供肝基因多态性这两大重要诱因,探讨mi R-33a在维持肝移植术后糖脂代谢稳态中的作用及分子机制,并进一步挖掘其潜在临床应用价值。研究方法:第一部分:构建模拟他克莫司应用动物模型,定量检测mi R-33a及其脂代谢相关靶基因的表达水平。利用非编码RNA数据库(Circ Base、mi R-Base)及其算法预测mi R-33a相关Circ RNA,构建circ RNA/mi RNA信号轴。应用荧光素酶报告实验揭示circ FASN和mi R-33a的相互作用,运用功能实验证实circ FASN和mi R-33a的相互关系及在调控脂代谢中的作用。通过沉默mi R-33来研究他克莫司诱导甘油三酯失调的机制。收集了73例肝移植受者的临床资料和样本,以验证mi R-33a在他克莫司相关血脂异常中的主导作用。在模拟他克莫司应用的小鼠模型上证实,mi R-33a可作为他克莫司引起脂代谢紊乱的潜在治疗靶点。第二部分:通过对肝癌肝移植受者临床数据和对应供肝样本检测,明确mi R-33a与肝移植术后代谢并发症的相关性。运用二代测序,寻找受mi R-33a调控的代谢关键调控因子。同时应用功能实验,如脂滴观测、糖生成、糖摄取和胰岛素敏感性检测等,进一步阐明肝脏mi R-33a对糖脂代谢的影响和潜在分子机制。过表达正常肝脏细胞内的mi R-33a,收集其培养基,模拟肝脏代谢微环境。将肿瘤细胞与该培养基共培养,CCK-8与transwell检测肝癌细胞增殖、迁移能力改变,评估mi R-33a导致的代谢微环境改变是否影响肿瘤细胞增殖和迁移能力。结果:第一部分:在他克莫司处理的细胞和小鼠模型中观察到他克莫司可以通过刺激甾醇反应元件结合蛋白(SREBPs)和mi R-33a诱导甘油三酯在肝细胞中积聚。接着,通过数据库及其算法预测和功能实验分析证实mi R-33a是Circ FASN的直接靶点。他克莫司在体内、体外均可下调Circ FASN,升高mi R-33a,抑制mi R-33a的靶基因表达,造成甘油三酯在肝脏沉积。过表达Circ FASN或沉默mi R-33a可降低他克莫司对甘油三酯积累的促进作用。通过对临床样本(n=73)的分析发现,肝移植术后血脂异常受者血清mi R-33a含量高于血脂正常受者,但是mi R-33a的升高与他克莫司的血药浓度没有明显相关性(R2=0.021)。第二部分:在85名肝癌肝移植受者供肝组织样本中,发现mi R-33a表达水平与术后血脂异常(p=0.0263)和肝内肝癌复发(p=0.087)存在关联,与肝移植术后新发糖尿病无明显关联(p=0.5542)。通过二代转录组测序,发现了一系列受mi R-33a调控的糖脂代谢关键调控分子,如ABCA1、ABCG1、G6PC和CPT1A等。应用透射电镜,在过表达mi R-33a的肝脏细胞内发现脂滴数量明显多于对照组细胞。激活肝X受体(LXR)后,mi R-33a功能同时激活,说明mi R-33a受到LXR调控。此外,过表达mi R-33a的肝脏细胞糖生成和糖摄取能力增加显著,证明mi R-33a参与维持糖代谢稳态。肝脏mi R-33a表达水平异常增高会破坏肝脏代谢微环境稳态。利用过表达mi R-33a肝脏细胞的培养基模拟其代谢微环境,发现肝癌细胞在其中增殖能力和侵袭能力增长明显。结论:1.Circ FASN/mi R-33a信号通路在他克莫司诱导的脂质稳态破坏中起着重要的作用,其中mi R-33a可作为他克莫司导致的脂代谢紊乱的潜在治疗靶点;2.供肝mi R-33a表达水平与肝移植术后代谢病的发生和肝癌肝内复发密切相关;3.mi R-33a的靶基因包括一系列糖脂代谢调控关键分子,并和LXR一起参与维持肝脏糖脂代谢微环境稳态;4.当供肝mi R-33a表达水平异常升高时导致供肝代谢微环境发生变化,这可能是引起肝移植术后肝癌肝内复发的分子机制之一。