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研究背景：肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤,在世界上HCC的死亡率在所有恶性肿瘤中位居第三位,每年有大约一百万人死于HCC。尽管针对HCC的治疗包括手术、射频、肝移植、靶向治疗药物如索拉菲尼等多种治疗方法,但其复发、转移比例仍较高。如此高死亡率的HCC被认为是一个复杂的与多种基因有关的疾病。迄今为止,多条信号通路与众多的生长因子、癌基因和抑癌基因等的异常表达或激活参与了HCC的发生及发展过程。因此探索HCC的发病机制、寻找新的诊断标记物和治疗靶点是提高治疗效果的关键。MicroRNA(miRNA)是近些年来被发现的一类非编码单链小RNA分子,其参与了众多的生物学过程,例如生长、增殖、分化和凋亡等过程。miRNA通过与它们的靶向mRNA的3’UTR区以不完全互补的方式结合,导致mRNA降解或抑制其翻译,通过这种机制miRNA降低了靶基因蛋白的表达水平。之前的研究已经证实miRNA的这种负性调节与多种人类肿瘤密切相关,比如乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等。因此深入研究miRNA在人体肿瘤中的表达及其功能,对探索肿瘤的发病机制具有重要意义,并将有利于对肿瘤的诊断、治疗及预后的判断。生长终止特异性同源盒基因(Growth Arrest-specific Homeobox, GAX)又被称为MEOX2基因,是同源盒基因家族成员之一,编码核转录因子并在血管平滑肌细胞(VSMCs)及血管内皮细胞(ECs)中表达。GAX曾被发现在多种肿瘤中过低表达,然而它与肝癌临床病理因素及预后的关系还知之甚少。目的：检测miR-301a在肝癌组织中的表达的情况,探讨miR-301a在HCC发生发展及侵袭转移中的相关功能机制,分析miR-301a的靶基因GAX与肝癌临床病理因素及预后的关系。方法：1.收集2011年2月-2011年5月在中南大学湘雅医院手术切除并经病理确诊的25例HCC患者新鲜的肝癌及其癌旁组织,以及6例血管瘤患者新鲜的瘤旁肝组织作为正常对照。采用实时荧光定量real-time PCR方法检测miR-301a在肝癌、癌旁及正常肝脏组织中的表达情况。同时用real-time PCR和western blot方法检测GAX的表达情况。选取三个肝癌细胞系HepG2、Huh7、LM3及正常肝细胞系L02用real-time PCR方法检测miR-301a的表达差异。2.将hsa-miR-301a inhibitor使用脂质体Lipofectamine2000转染入HepG2细胞,同时设置阴性对照组和空白对照组。Real-timePCR检测转染后miR-301a表达情况。同时用real-time PCR和western blot方法检测下游靶点GAX的表达水平。MTT法检测细胞的增殖并绘制生长曲线；Transwell法检测细胞迁移和侵袭的能力；流式细胞术检测细胞的凋亡。3.运用生物信息学(miRbase,TargetScan, miRanda)的方法,预测GAX为其可能的下游靶点并用双荧光素酶报告基因系统验证。用GAX质粒pEGFP-C1-GAX转染HepG2细胞,用vestern blot方法检测下游蛋白NF-κB的表达水平。4.收集2006-2007年中南大学湘雅医院手术切除并经病理确诊的94例HCC患者石蜡切片,采用免疫组织化学方法检测GAX蛋白在肝癌及癌旁的表达情况。分析GAX表达与肝癌临床病理因素之间的关系,根据GAX的表达水平用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。结果：1.用real-time PCR检测肝癌组织中miR-301a相对表达量为0.05494±0.03649,明显高于癌旁组织的0.02681±0.02056和正常肝脏组织中的0.01306±0.00613(P<0.01)。在恶性程度高的肝癌组织中miR-301a的相对表达量0.06839±0.04112明显高于恶性程度低的组织0.03783±0.02054(P<0.05),同时也发现在肝癌细胞系中miR-301a的表达也较肝细胞系明显升高(P<0.01)2. HepG2细胞转染miR-301a inhibitor后real-time PCR检测证实miR-301a被成功抑制。MTT法检测细胞增殖显示miR-301a抑制后24-72小时活细胞数量明显低于对照组(P<0.05)。抑制miR-301a的表达后,HepG2细胞迁移能力约为阴性对照组的40%,侵袭能力约为阴性对照组的60%,两者都有统计学意义(P<0.01)。此外抑制miR-301a的表达后早期和晚期凋亡细胞数较对照组明显增多(P<0.01)。3.用生物信息学及双荧光素酶方法预测GAX为miR-301a的下游靶点。Real-time PCR和western blot均证实miR-301a抑制后GAX的表达量有不同程度的升高。miR-301a抑制后以及增强GAX表达后,western blot方法检测NF-κB的表达水平均有所下降,提示miR-301a可能通过抑制GAX基因间接地作用于NF-κB的表达。4.用real-time PCR检测肝癌组织中GAX相对表达量为0.00568±0.00308,明显低于癌旁组织的0.00792±0.00386和正常肝脏组织中的0.01164±0.00314,结果有统计学差异(P<0.05)。用western blot的方法也证实肝癌组织中GAX蛋白表达量明显低于癌旁和正常组织(P<0.05)。在恶性程度低的肝癌组织中GAX的相对表达量为0.00715±0.00315明显高于恶性程度高的组织0.00452±0.00198(P<0.05)。将肝癌组织中miR-301a和GAX的相对表达量进行相关性分析,表明两者呈负相关,结果有统计学意义(r=-0.498,P<0.05)。5.免疫组化结果显示GAX主要表达在细胞核中,在肝癌组织中以阴性表达为主,而癌旁及正常组织中主要为阳性表达。GAX表达水平与肝癌的Edmondson分级、包膜侵犯、血管侵犯相关。GAX的低表达提示肝癌患者更短的无瘤生存期及总体生存期。结论：1.miR-301a在肝癌组织及肝癌细胞系中高表达。miR-301a表达抑制后,HepG2细胞增殖减慢、侵袭迁移能力降低、凋亡细胞数增多,miR-301a可能成为肝癌基因治疗的一个潜在靶点。2.用生物信息学及双荧光素酶方法预测GAX为]niR-301a的下游靶点之一。miR-301a表达抑制后,HepG2细胞中GAX表达升高,NF-κB的表达降低,三者可能共同参与调控肝癌的信号通路。3.GAX在肝癌组织中低表达,表达水平与肝癌的Edmondson分级、包膜侵犯、血管侵犯相关。GAX的低表达提示更短的无瘤生存期和总生存期,GAX可能在肝癌发生发展过程中发挥重要作用。