【摘 要】
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玉米（Zea mays L.）是禾本科玉蜀黍一年生草本植物,是世界上三大主要作物之一,也是重要的粮食作物和饲料作物。玉米淀粉是世界上淀粉的主要来源,所以提高玉米淀粉含量,改良种质资源是一项极具价值的研究。玉米腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成过程中的关键限速酶,其催化腺苷三磷酸（ATP）和1-磷酸葡萄糖（G-1-P）生成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）和焦磷酸（PPi）。在玉米中,A
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玉米（Zea mays L.）是禾本科玉蜀黍一年生草本植物,是世界上三大主要作物之一,也是重要的粮食作物和饲料作物。玉米淀粉是世界上淀粉的主要来源,所以提高玉米淀粉含量,改良种质资源是一项极具价值的研究。玉米腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成过程中的关键限速酶,其催化腺苷三磷酸（ATP）和1-磷酸葡萄糖（G-1-P）生成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）和焦磷酸（PPi）。在玉米中,AGPase是由大亚基Sh2和小亚基Bt2组成的异源四聚体。研究表明,AGPase受到三种调控,即氧化还原调控,小分子变构调控和转录调控。近来的研究发现,玉米AGPase还存在磷酸化调控。实验室前期的研究发现,AGPase小亚基Bt2在玉米体内存在磷酸化调控,并鉴定到Bt2蛋白在第10位点的丝氨酸（Ser）、第451位点的苏氨酸（Thr）和第462位点的苏氨酸发生磷酸化。本研究针对这三个位点制备了磷酸化抗体,并用位点突变来探究这三个位点对AGPase活性的影响,取得了以下结果:1.SnRK2.10是AGPase小亚基Bt2潜在的激酶。用Bt2抗体免疫共沉淀（Co IP）Mo17授粉后15天和20天的玉米籽粒蛋白,将20天免疫沉淀物送公司进行质谱鉴定。结果显示与Bt2存在相互作用的激酶有11个,Sn RK2.6、Sn RK2.8、Sn RK2.10同属于Ser/Thr蛋白激酶,对其与Bt2之间的互作关系进行了验证。酵母双杂和Pull-Down实验均证明Sn RK2.10与Bt2存在相互作用。2.制备Bt2-S10,Bt2-T451,Bt2-T462位点磷酸化抗体,并检测玉米体内的磷酸化水平。首先体外合成Phos-Bt2-S10、Phos-Bt2-T451、Phos-Bt2-T462肽段,对这些特异性磷酸化位点进行了磷酸化修饰。用多肽作为抗原进行兔免疫,获得针对特异性磷酸化位点的检测抗体。用免疫前血清、Bt2抗体和Phos-Bt2-S10、Phos-Bt2-T451、Phos-Bt2-T462抗体分别对Mo17授粉后的玉米胚乳蛋白以及bt2突变体的蛋白进行Western Blot检测,验证抗体的有效性。3.磷酸化位点突变后对Bt2亚细胞定位的影响。本研究将AGPase小亚基Bt2-S10、Bt2-T451,Bt2-T462位点分别突变为丙氨酸（A）来模拟去磷酸化,突变为谷氨酸（E）来模拟磷酸化;并将这三个位点同时突变为A或E,以此来验证单个位点突变和多个位点突变的影响。结果表明,成功获得了Bt2-S10A、Bt2-S10E、Bt2-T451A、Bt2-T451E、Bt2-T462A、Bt2-T462E、Bt2-S10/T451/T462A、Bt2-S10/T451/T462E这8个Bt2的点突变类型。通过玉米叶片原生质体转染实验发现,野生型小亚基Bt2在细胞核、细胞膜和叶绿体中均有信号。模拟去磷酸化的Bt2-S10/T451/T462A定位与野生型一致,而Bt2-S10/T451/T462E、Bt2-S10A、Bt2-S10E、Bt2-T462E在细胞核有信号,Bt2-T451A在细胞膜和细胞核中有信号、Bt2-T451E在细胞核和叶绿体中有信号,Bt2-T462A只位于叶绿体上。4.Bt2磷酸化位点突变后与大亚基Sh2的互作关系。酵母双杂实验发现,不同突变类型均与Sh2有互作。荧光双分子互补结果表明Bt2-N YFP不同突变类型与Sh2-C YFP融合蛋白均存在蛋白相互作用,且仅定位在叶绿体。5.磷酸化位点突变后对AGPase活性的影响。不同突变类型与221-Sh2共转玉米叶片原生质体,用原生质体瞬时表达来进行酶活的测定。实验表明,全突变为E即模拟磷酸化的活性略高于野生型,其它突变类型的活性均低于野生型。Bt2磷酸化位点突变会影响AGPase的活性,其中模拟三个位点同时磷酸化可能会提高AGPase活性。综上所述,小亚基Bt2在玉米体内存在磷酸化,蛋白激酶Sn RK2.10可能是小亚基Bt2潜在的激酶,小亚基Bt2不同突变类型不影响其与大亚基Sh2的互作关系,但是对小亚基的亚细胞定位有所影响,全突变为E的酶活性比野生型高,其余突变均低于野生型。
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