论文部分内容阅读
本论文采用超声波热水浸提、DEAE Cellulose-52阴离子交换层析、自由基氧化降解以及Superdex 75凝胶柱层析法制备得到不同级别的马尾藻岩藻聚糖硫酸酯（fucoidan）并对其进行化学组成分析;采用GC-MS、凝胶过滤层析法、红外光谱法对马尾藻fucoidan进行结构分析;通过体外血凝块溶解实验及小鼠肺栓塞实验初步评价马尾藻fucoidan的抗血栓活性,并通过小鼠断尾出血实验探讨其出血性危险;培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）研究不同级别fucoidan对HUVEC增殖及分泌功能的影响,以探讨其抗血栓作用途径及机理,旨在为马尾藻fucoidan作为抗血栓功能性食品提供数据支撑,为提升马尾藻的利用价值、开发特色海藻资源提供基础。主要研究内容如下:（1）通过超声波热水浸提制备得马尾藻fucoidan粗品（F）,通过DEAE-C-52离子交换层析法对F进行纯化得两个组分F1、F2,将F1通过不同条件的自由基氧化降解,制得DF1、DF2,分别经Superdex 75 prep grade凝胶柱进一步纯化,按峰收集,得DF11、DF12和DF21、DF22四个组分。检测F、F1、F2、DF1、DF2的多糖含量分别为32.86%、58.62%、50.74%、49.27%、54.38%;硫酸基含量分别为12.76%、20.78%、21.08%、17.52%、17.73%;岩藻糖含量分别为15.62%、24.87%、19.43%、24.92%、28.34%;糖醛酸含量分别为:11.93%、13.86%、9.52%、10.85%、9.56%。F脱蛋白前后及F1的蛋白含量分别为9.41%、6.02%、3.61%。检测DF11、DF12、DF21、DF22的硫酸基含量分别为15.07%、9.66%、15.15%、10.48%;岩藻糖含量分别为18.97%、13.37%、24.81%、10.48%。紫外光谱扫描可知F1较F相比,蛋白含量明显减少,降解后的fucoidan几乎不含蛋白质。（2）通过GC-MS法测定F及F1的单糖组成,可知二者均是由岩藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等多种单糖组成的复杂物质,但各组分所含单糖的种类和比例均不相同,F1检出的单糖种类比F更丰富。测得F、F1的平均相对分子质量分别为56.77万、43.93万。DF11、DF12、DF21、DF22均是较为单一的组分,平均相对分子质量分别为20277、6166、19953、7493。红外光谱扫描结果表明几种fucoidan组分均含多糖及硫酸基的特征吸收峰,且其糖苷键类型为β-糖苷键。核磁共振1H NMR及13C NMR表明马尾藻fucoidan由岩藻糖等多种单糖组成,且含有硫酸基团,其异头碳存在α和β两种构型。（3）通过体外血凝块溶解实验、建立肺栓塞小鼠模型初步比较评价fucoidan粗品F及F1对血栓的作用,并通过出血实验评价二者的出血性危险。结果表明,中、高剂量的F、F1有显著的血块溶解作用（P<0.05）,高剂量的F1能显著提高肺栓塞模型小鼠的存活率（P<0.05）,2种fucoidan的出血时间与生理盐水对照组均有显著差异（P<0.05）,且都显著小于肝素钠阳性对照组（P<0.05）。实验证明,fucoidan具有良好的抗血栓活性,出血性危险较小,且呈剂量依赖性。（4）比较研究F1、DF1、DF12、DF21、DF22五种马尾藻fucoidan对肾上腺素（Adr）诱导的HUVEC损伤模型的保护作用,并通过酶联免疫法（ELISA）研究马尾藻fucoidan对内皮细胞分泌vWF、t-PA、PAI-1、TF、TFPI的影响,初步探讨其可能的抗血栓途径。结果表明,5种fucoidan均对内皮细胞有保护作用,能拮抗肾上腺素对内皮细胞造成的损伤,增强受损内皮细胞的增殖活性;能减少内皮细胞分泌vWF,阻断血小板与受损血管内皮暴露的胶原等结合,从而抑制血小板活化,抑制血小板的粘附与聚集;能降低受损内皮细胞分泌、释放PAI-1,提高t-PA/PAI-1比值,增强内皮细胞的纤溶活性;能减少Adr引起的TF含量增加,抑制外源性凝血系统发挥凝血作用;但其并不能明显增加TFPI的释放,对外源性凝血系统的影响较弱。马尾藻fucoidan可通过以上多条途径发挥抗血栓作用。